【系列2】胎牛血清RNA干擾了細(xì)胞培養(yǎng)外源性RNA

（e）基于主要的RNA的組合物的對數(shù)變換后的數(shù)據(jù)的皮爾遜聚類分析顯示來自三個粒料樣品三個上清液樣品分離（表示為S）（表示為P）。

（f）在最豐富的miRNA在FBS的沉淀和上清液的級分（24小時UC）通過RNA-SEQ所檢測。值得注意的是，的miR-451不從NEBNext小RNA文庫進行測序。

（g）FBS的沉淀和上清液中選擇的miRNA的水平通過qRT-PCR測定。每組n=3的FBS等分試樣。

（h）牛和靈長類特異性的miR-1246是通過qRT-PCR在小鼠培養(yǎng)的細(xì)胞，但不小鼠組織檢測。N=3的細(xì)胞或每組組織切片。*P<0.05;**P<0.01;NS，不顯著。所有的棒表示平均±SEM所示。

RNA，不能從FBS的使用超速離心耗盡

我們接下來設(shè)置來表征FBS的RNA的組合物，并調(diào)查是否RNA可從血清中除去。血清的RNA與外來體和其他電動汽車，以及非膜脂和蛋白質(zhì)的RNP相關(guān)聯(lián)。大多數(shù)研究人員使用70000克到110000克UC2小時，18小時，生產(chǎn)vdFBS。

已經(jīng)證實，長時間的UC除去大部分，雖然不是所有的電動車，如通過NanoSight監(jiān)測12。但是，什么延長vdFBS是RNA耗盡尚不清楚。為了解決這個問題，我們紡絲FBS的樣品以100,000g為80分鐘，5小時，或24小時，并分離總RNA從沉淀（即EV-富集）材料和上清液（即EV-耗盡。RNA也從在基線粗FBS的隔離。5-40納克/毫升總RNA從粗FBS分離，鱗和批次間變化，并與人血清的以前的評估一致13。如圖所示。1c中，即使是長時間的24小時的UC延伸超過報協(xié)議，僅除去從FBS（RNA的（19-33％）的一部分圖1c）。平均起來，vdFBS制劑含有34納克/毫升的RNA，其中大部分是最有可能與非囊泡復(fù)合物，如的RNP相關(guān)聯(lián)。無論該RNA（水泡與否）的源，它可以潛在地污染細(xì)胞培養(yǎng)物條件培養(yǎng)基和共分離物/沉淀用在隨后的程序在細(xì)胞培養(yǎng)的電動汽車。

FBS包含人類和小鼠的成績單無法區(qū)分保守的RNA種類多樣的劇目

為了進一步評價FBS RNA與衍生exRNA細(xì)胞培養(yǎng)干擾的潛力，我們進行了FBS分?jǐn)?shù)RNA深度測序。FBS的三個不同批次100,000g下離心24小時，并從沉淀的EV-富集級分和EV-耗盡上清中分離的RNA樣品用于NEBNext小RNA文庫的構(gòu)建，隨后HiSeq2000RNA的起。閱讀映射人類基因組hg19版本使用摘錄Genboree工作臺的小RNA-SEQ管道V2.2.8使用默認(rèn)參數(shù)進行14。平均而言,13.6％和21.7％讀取來自“沉淀的RNA”和“上清液的RNA”的級分，分別映射到人類基因組，這表明FBS相關(guān)轉(zhuǎn)錄的顯著一部分進化上保守的，并且可以有助于假陽性人類細(xì)胞的分析。具有精確無失配**的映射允許，9.2％和各個級分的13.2％中讀取映射到人類基因組。兩個級分的主要的RNA的組合物，表示每百萬映射（RPM），為讀出，示于圖1D。