支原體檢測 常見答疑

問：在用qEP做支原體檢測的時候，加入內控對照品，在儀器設置上是需要選擇兩個通道嗎？

答：是需要2個通道，一個FAM, 一個HEX，HEX是對應內控的通道。

問：我想問一下，7500儀器里面沒有HEX這個通道選項，可以用哪個通道代替呢？

答：7500這款是沒有HEX熒光標識，不過問過廠家，說7500有VIC，可以用VIC通道。

問：qPCR結果判定中，FAM positive，HEX irrelevant中這個不相關是具體指什么？

答：這個不相關是指如果FAM是陽性，那么由于擴增時存在競爭性抑制，所以內控是否有擴增，其無關緊要。

問：在用樣品制備試劑盒時，進行支原體DNA提取時，加入內控對照品，實際上是監控在提取操作總是否能夠binding支原體DNA，而無法監測這步操作的回收率的，是嗎？

答：“實際上是監控在提取操作總是否能夠binding支原體DNA”，可以這么理解，或者說是在監測整個提取過程。我們又問了一下廠家，內控和樣品的提取效率是一樣的，這樣可以反映樣品的真實情況，因為只要內控提取后能測出來，那就表明提取是沒有問題的。極少量的支原體如10CFU的，通過提取，也是可以檢測到的，表明靈敏度是沒有問題的。樣本Ct值和10CFU的Ct值比較，是可以進行相對定量的。

問：你們好，我問一下你們這個Venor Gem qEP試劑盒能做放行檢測嗎?

答：放行應相當于國外說的release testing, 這個qEP試劑盒是符合國外藥典規定的性能，能做放行檢測的。同時需注意要做支原體DNA抽提才行，抽提是用另外一個盒子，見廠家的venor gem sample preparation kit。

問：這個如果是用來檢測細胞上清，是不是就不用提取DNA了呢？

答：只要是跟藥典有關，跟臨床治療或制藥檢驗有關，就需要提取DNA。如果僅僅是科研用培養細胞，篩查支原體，則可以不提。

問：詢問qPCR儀器的設置

答：具體可見MB廠家文件Venor^?GeM qEP: Cyclers Programming，可從網站上下載。

問：被動參比染料是選“none”吧？

答：對，沒有ROX，選none

問：大家好，想咨詢一下，咱們支原體DNA提取時所取的樣本量是依據什么定的呢，比如，我們有CAR-T細胞，病毒液等，如果CAR-T細胞按細胞數來的話取多少細胞數比較好，或者如果病毒液按體積的話多少體積更佳呢？

答：支原體 DNA 提取試劑盒可從最多含有 1X 10⁶細胞/ml 的細胞上清中直接分離 DNA，病毒沒有要求。總體積最多 200μl。提取的樣本就是細胞上清，ATMPs（高級醫用藥品），細胞培養基等。病毒液應該也是最初來自細胞上清吧。樣本量是根據支原體污染量得出的經驗值，跟核酸純化柱上的DNA膜吸附能力有關。

問：病毒液就是類似細胞上清的。如果體積大于200ul的話我們可以濃縮，但是這個體積有沒有一個上限呢？

答：體積有上限，是200 to 1000 μl, 可以參看經典法試劑盒的那個說明書里對樣本處理那一塊。這個樣本量同時還考慮了靈敏度，使檢測達到**的靈敏度。如果細胞數高于1X 10⁶細胞/ml ，那必須要先調細胞數了。或者減少樣本體積，總細胞數不超，也行。

問：您好，我這邊要提取10cfu對照品的基因組，10cfu對照品的說明書寫著用1ml基質重懸，基因提取試劑盒說一次上樣200μl進行提取，想問您一下，用200μl基質重懸10cfu可以嗎，想一次提完。

答：還是建議用1ml的基質重懸，因為靈敏度是以10CFU/ml為單位的。如果用200ul，濃度就高了。廠家建議10CFU標準品復溶了以后，要立即用完，不要再保存，擔心可能降解。

問：那1ml溶解的標準品，按提取試劑盒的要求，就得用多個管子一次提完對吧？

答：是的。

問：這個抽提試劑盒的收率有多少，是磁珠還是吸附柱？吸附柱的收率**能有，因為以前我們用其他品牌的抽提試劑盒，收率只有百分之六，這樣的話，就存在假陰性結果的可能。

答：是吸附柱的方法。提取試劑盒的COA里，用的是很少量的支原體10CFU/ml，提取DNA后都可以檢測到。廠家來信說，產率依賴于DNA的類型（如GC含量，是基因組還是質粒）、操作者的技巧以及樣本基質的情況。因為這些情況，操作者很難達到生產商所給的比率，從而形成各種討論，因此產率沒寫到說明書里。

問：要檢測支原體的培養基中有酚紅，是否還需要抽提？

答：只要是在25ulPCR體系中加入的樣本量≤2ul，酚紅就不會對qPCR構成問題。更高濃度的酚紅會引起基線偏移，造成靈敏度降低。如果僅僅是篩查，則不需要抽提DNA。如果是做10CFU/ml的產品放行檢查，則需要抽提了。細胞基質的驗證總是要做的。

問：做qPCR，一個陰性對照Ct約為40，也有擴增曲線。是什么原因？

答：Ct值大于40可能是由于產生非特異性信號（如primer artefacts）以及極微小的污染所致。 但是，該結果是不具有可重復性的，因此結果仍然是陰性。

問：一步法的盒子的靈敏度是否總低于經典法試劑盒？有沒有可能一步法的盒子也能檢測10CFU？

答：廠家回復如下：意思是一步法的樣本量為2ul用于支原體篩查，經典法為10ul，用于產品的放行檢測。檢測10CFU的標準品非常具有挑戰性。一步法因為樣本量不夠，很難達到10CFU/ml。如果客戶想要包含DNA聚合酶的PCR試劑盒，可以選擇VenorGeM Classic G型試劑盒。它和經典法（不含酶）的交叉驗證確實做過，顯示同樣的靈敏度。但全套的驗證沒有做過。

問：支原體10cfu標準品是干粉吧？ 配完后是多少體積？

答：是凍干粉，加基質液后是1ML體積。

問：基質液產品里帶嗎？

答：這個產品里不帶，是客戶自己要檢測哪類樣品，就用樣品里的基質液（例如用的哪個培養基）

問：PCR經典法，跑膠時體現1條陽性帶，是否代表PCR經典法可以檢測多種支原體，無法區分支原體種類。

答：PCR經典法，跑膠時為1條陽性帶，無法區分支原體種類，需要將擴增產物測序鑒定。

問：?支原體標準品一管可以用幾次？

答：1管可以用4次，廠家原文是actually you will get 4x 200 ul out of one vial. The kit consists of 3 vials. Replicates of 8 tests are usually required for a validation. So 2 tubes are needed and 1 is for safety.

問：qEP的陽性對照一個25次的盒子里大概可以做幾次？

答：這個陽性對照是綠蓋管，復溶是加300ul水。如果是科研，每次用2ul。制藥是每次用10ul，這樣分別是做150次和30次。但是大包裝的qEP的陽性對照仍然只是1管或2管。

問：10CFU標準品，驗證實驗中用量，即驗證實驗時需多少有效數據？

答：10CFU標準品，使用時需要用1ml你的樣本基質（如培養基）溶解，然后需要提取支原體DNA，以保證最高靈敏度（推薦MB公司的支原體DNA提取試劑盒）。每個DNA純化柱需要樣本量是200ul，產出是50ul。每個qPCR反應需要加DNA樣本量是10ul。MB廠家推薦1個樣本是8個復孔。一般靈敏度與耐用性（Robust）是在一起驗證的，也就是說，要前后做3輪獨立試驗，每次每個樣本建議是8個復孔，這樣計算下來，2管10CFU標準品是夠用了，這也正是10CFU標準品現在的包裝。說明：為保證結果可靠性，還需要同時做陰性對照。

問：qPCR法，是否需要分別用不同種類DNA定量標準品分別做標曲，來檢測同一個樣本，那引物探針是否是根據不同種類支原體而不同。

答：qPCR法，如要定量，先需確定是測定哪種支原體，再用該支原體DNA標準品做標曲。引物探針都是用的MB公司的同一mix，它可識別多種支原體物種。

問：一管DNA定量標準品稀釋后能用多久，如何保存。

答：一管DNA定量標準品稀釋后在-18℃以下保存。避免反復凍融。保存時間和標簽上的效期一樣。

問：如何設置閾值線？ 據我所知，基線通常是循環3到循環15的值。閾值線是基線標準差的10倍。這正確嗎？

答：設置閾值的一種好方法是將其置于陽性對照擴增曲線的線性區域的中間（如果以對數坐標顯示）。

問：內控對照的曲線和樣品擴增曲線是否共享同一閾值線？

回答：是的。

問：是否每次做支原體DNA抽提時都要設陰性對照？

答：不需要。只有靈敏度標準品抽提時才需要設陰性對照，以避免外源干擾。