支原體檢測(cè) 常見答疑

問：在用qEP做支原體檢測(cè)的時(shí)候，加入內(nèi)控對(duì)照品，在儀器設(shè)置上是需要選擇兩個(gè)通道嗎？

答：是需要2個(gè)通道，一個(gè)FAM, 一個(gè)HEX，HEX是對(duì)應(yīng)內(nèi)控的通道。

問：我想問一下，7500儀器里面沒有HEX這個(gè)通道選項(xiàng)，可以用哪個(gè)通道代替呢？

答：7500這款是沒有HEX熒光標(biāo)識(shí)，不過問過廠家，說7500有VIC，可以用VIC通道。

問：qPCR結(jié)果判定中，FAM positive，HEX irrelevant中這個(gè)不相關(guān)是具體指什么？

答：這個(gè)不相關(guān)是指如果FAM是陽性，那么由于擴(kuò)增時(shí)存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制，所以內(nèi)控是否有擴(kuò)增，其無關(guān)緊要。

問：在用樣品制備試劑盒時(shí)，進(jìn)行支原體DNA提取時(shí)，加入內(nèi)控對(duì)照品，實(shí)際上是監(jiān)控在提取操作總是否能夠binding支原體DNA，而無法監(jiān)測(cè)這步操作的回收率的，是嗎？

答：“實(shí)際上是監(jiān)控在提取操作總是否能夠binding支原體DNA”，可以這么理解，或者說是在監(jiān)測(cè)整個(gè)提取過程。我們又問了一下廠家，內(nèi)控和樣品的提取效率是一樣的，這樣可以反映樣品的真實(shí)情況，因?yàn)橹灰獌?nèi)控提取后能測(cè)出來，那就表明提取是沒有問題的。極少量的支原體如10CFU的，通過提取，也是可以檢測(cè)到的，表明靈敏度是沒有問題的。樣本Ct值和10CFU的Ct值比較，是可以進(jìn)行相對(duì)定量的。

問：你們好，我問一下你們這個(gè)Venor Gem qEP試劑盒能做放行檢測(cè)嗎?

答：放行應(yīng)相當(dāng)于國外說的release testing, 這個(gè)qEP試劑盒是符合國外藥典規(guī)定的性能，能做放行檢測(cè)的。同時(shí)需注意要做支原體DNA抽提才行，抽提是用另外一個(gè)盒子，見廠家的venor gem sample preparation kit。

問：這個(gè)如果是用來檢測(cè)細(xì)胞上清，是不是就不用提取DNA了呢？

答：只要是跟藥典有關(guān)，跟臨床治療或制藥檢驗(yàn)有關(guān)，就需要提取DNA。如果僅僅是科研用培養(yǎng)細(xì)胞，篩查支原體，則可以不提。

問：詢問qPCR儀器的設(shè)置

答：具體可見MB廠家文件Venor^?GeM qEP: Cyclers Programming，可從網(wǎng)站上下載。

問：被動(dòng)參比染料是選“none”吧？

答：對(duì)，沒有ROX，選none

問：大家好，想咨詢一下，咱們支原體DNA提取時(shí)所取的樣本量是依據(jù)什么定的呢，比如，我們有CAR-T細(xì)胞，病毒液等，如果CAR-T細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)來的話取多少細(xì)胞數(shù)比較好，或者如果病毒液按體積的話多少體積更佳呢？

答：支原體 DNA 提取試劑盒可從最多含有 1X 10⁶細(xì)胞/ml 的細(xì)胞上清中直接分離 DNA，病毒沒有要求。總體積最多 200μl。提取的樣本就是細(xì)胞上清，ATMPs（高級(jí)醫(yī)用藥品），細(xì)胞培養(yǎng)基等。病毒液應(yīng)該也是最初來自細(xì)胞上清吧。樣本量是根據(jù)支原體污染量得出的經(jīng)驗(yàn)值，跟核酸純化柱上的DNA膜吸附能力有關(guān)。

問：病毒液就是類似細(xì)胞上清的。如果體積大于200ul的話我們可以濃縮，但是這個(gè)體積有沒有一個(gè)上限呢？

答：體積有上限，是200 to 1000 μl, 可以參看經(jīng)典法試劑盒的那個(gè)說明書里對(duì)樣本處理那一塊。這個(gè)樣本量同時(shí)還考慮了靈敏度，使檢測(cè)達(dá)到**的靈敏度。如果細(xì)胞數(shù)高于1X 10⁶細(xì)胞/ml ，那必須要先調(diào)細(xì)胞數(shù)了。或者減少樣本體積，總細(xì)胞數(shù)不超，也行。

問：您好，我這邊要提取10cfu對(duì)照品的基因組，10cfu對(duì)照品的說明書寫著用1ml基質(zhì)重懸，基因提取試劑盒說一次上樣200μl進(jìn)行提取，想問您一下，用200μl基質(zhì)重懸10cfu可以嗎，想一次提完。

答：還是建議用1ml的基質(zhì)重懸，因?yàn)殪`敏度是以10CFU/ml為單位的。如果用200ul，濃度就高了。廠家建議10CFU標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶了以后，要立即用完，不要再保存，擔(dān)心可能降解。

問：那1ml溶解的標(biāo)準(zhǔn)品，按提取試劑盒的要求，就得用多個(gè)管子一次提完對(duì)吧？

答：是的。

問：這個(gè)抽提試劑盒的收率有多少，是磁珠還是吸附柱？吸附柱的收率**能有，因?yàn)橐郧拔覀冇闷渌放频某樘嵩噭┖校章手挥邪俜种@樣的話，就存在假陰性結(jié)果的可能。

答：是吸附柱的方法。提取試劑盒的COA里，用的是很少量的支原體10CFU/ml，提取DNA后都可以檢測(cè)到。廠家來信說，產(chǎn)率依賴于DNA的類型（如GC含量，是基因組還是質(zhì)粒）、操作者的技巧以及樣本基質(zhì)的情況。因?yàn)檫@些情況，操作者很難達(dá)到生產(chǎn)商所給的比率，從而形成各種討論，因此產(chǎn)率沒寫到說明書里。

問：要檢測(cè)支原體的培養(yǎng)基中有酚紅，是否還需要抽提？

答：只要是在25ulPCR體系中加入的樣本量≤2ul，酚紅就不會(huì)對(duì)qPCR構(gòu)成問題。更高濃度的酚紅會(huì)引起基線偏移，造成靈敏度降低。如果僅僅是篩查，則不需要抽提DNA。如果是做10CFU/ml的產(chǎn)品放行檢查，則需要抽提了。細(xì)胞基質(zhì)的驗(yàn)證總是要做的。

問：做qPCR，一個(gè)陰性對(duì)照Ct約為40，也有擴(kuò)增曲線。是什么原因？

答：Ct值大于40可能是由于產(chǎn)生非特異性信號(hào)（如primer artefacts）以及極微小的污染所致。 但是，該結(jié)果是不具有可重復(fù)性的，因此結(jié)果仍然是陰性。

問：一步法的盒子的靈敏度是否總低于經(jīng)典法試劑盒？有沒有可能一步法的盒子也能檢測(cè)10CFU？

答：廠家回復(fù)如下：意思是一步法的樣本量為2ul用于支原體篩查，經(jīng)典法為10ul，用于產(chǎn)品的放行檢測(cè)。檢測(cè)10CFU的標(biāo)準(zhǔn)品非常具有挑戰(zhàn)性。一步法因?yàn)闃颖玖坎粔颍茈y達(dá)到10CFU/ml。如果客戶想要包含DNA聚合酶的PCR試劑盒，可以選擇VenorGeM Classic G型試劑盒。它和經(jīng)典法（不含酶）的交叉驗(yàn)證確實(shí)做過，顯示同樣的靈敏度。但全套的驗(yàn)證沒有做過。

問：支原體10cfu標(biāo)準(zhǔn)品是干粉吧？ 配完后是多少體積？

答：是凍干粉，加基質(zhì)液后是1ML體積。

問：基質(zhì)液產(chǎn)品里帶嗎？

答：這個(gè)產(chǎn)品里不帶，是客戶自己要檢測(cè)哪類樣品，就用樣品里的基質(zhì)液（例如用的哪個(gè)培養(yǎng)基）

問：PCR經(jīng)典法，跑膠時(shí)體現(xiàn)1條陽性帶，是否代表PCR經(jīng)典法可以檢測(cè)多種支原體，無法區(qū)分支原體種類。

答：PCR經(jīng)典法，跑膠時(shí)為1條陽性帶，無法區(qū)分支原體種類，需要將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序鑒定。

問：?支原體標(biāo)準(zhǔn)品一管可以用幾次？

答：1管可以用4次，廠家原文是actually you will get 4x 200 ul out of one vial. The kit consists of 3 vials. Replicates of 8 tests are usually required for a validation. So 2 tubes are needed and 1 is for safety.

問：qEP的陽性對(duì)照一個(gè)25次的盒子里大概可以做幾次？

答：這個(gè)陽性對(duì)照是綠蓋管，復(fù)溶是加300ul水。如果是科研，每次用2ul。制藥是每次用10ul，這樣分別是做150次和30次。但是大包裝的qEP的陽性對(duì)照仍然只是1管或2管。

問：10CFU標(biāo)準(zhǔn)品，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中用量，即驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)需多少有效數(shù)據(jù)？

答：10CFU標(biāo)準(zhǔn)品，使用時(shí)需要用1ml你的樣本基質(zhì)（如培養(yǎng)基）溶解，然后需要提取支原體DNA，以保證最高靈敏度（推薦MB公司的支原體DNA提取試劑盒）。每個(gè)DNA純化柱需要樣本量是200ul，產(chǎn)出是50ul。每個(gè)qPCR反應(yīng)需要加DNA樣本量是10ul。MB廠家推薦1個(gè)樣本是8個(gè)復(fù)孔。一般靈敏度與耐用性（Robust）是在一起驗(yàn)證的，也就是說，要前后做3輪獨(dú)立試驗(yàn)，每次每個(gè)樣本建議是8個(gè)復(fù)孔，這樣計(jì)算下來，2管10CFU標(biāo)準(zhǔn)品是夠用了，這也正是10CFU標(biāo)準(zhǔn)品現(xiàn)在的包裝。說明：為保證結(jié)果可靠性，還需要同時(shí)做陰性對(duì)照。

問：qPCR法，是否需要分別用不同種類DNA定量標(biāo)準(zhǔn)品分別做標(biāo)曲，來檢測(cè)同一個(gè)樣本，那引物探針是否是根據(jù)不同種類支原體而不同。

答：qPCR法，如要定量，先需確定是測(cè)定哪種支原體，再用該支原體DNA標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)曲。引物探針都是用的MB公司的同一mix，它可識(shí)別多種支原體物種。

問：一管DNA定量標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后能用多久，如何保存。

答：一管DNA定量標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后在-18℃以下保存。避免反復(fù)凍融。保存時(shí)間和標(biāo)簽上的效期一樣。

問：如何設(shè)置閾值線？ 據(jù)我所知，基線通常是循環(huán)3到循環(huán)15的值。閾值線是基線標(biāo)準(zhǔn)差的10倍。這正確嗎？

答：設(shè)置閾值的一種好方法是將其置于陽性對(duì)照擴(kuò)增曲線的線性區(qū)域的中間（如果以對(duì)數(shù)坐標(biāo)顯示）。

問：內(nèi)控對(duì)照的曲線和樣品擴(kuò)增曲線是否共享同一閾值線？

回答：是的。

問：是否每次做支原體DNA抽提時(shí)都要設(shè)陰性對(duì)照？

答：不需要。只有靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品抽提時(shí)才需要設(shè)陰性對(duì)照，以避免外源干擾。