CRISPR Cas9高效編輯基因組規(guī)則

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是目前發(fā)現(xiàn)存在于大多數(shù)細(xì)菌與所有古生菌中的一種免疫系統(tǒng)，被用來(lái)識(shí)別和摧毀入侵的噬菌體和其他的病原體。在這種系統(tǒng)中，CRISPR是規(guī)律間隔性成簇短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）的簡(jiǎn)稱。在過(guò)去5年里，CRISPR/Cas9作為一種有效切割DNA的工具在科學(xué)界廣受歡迎。它經(jīng)改造后用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。本質(zhì)上，這種工具是一套精簡(jiǎn)的分子“剪刀”。

科學(xué)家們普遍認(rèn)為，細(xì)胞通過(guò)隨機(jī)地插入一組核苷酸來(lái)修復(fù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導(dǎo)的DNA斷裂。這通常會(huì)破壞任何位于發(fā)生斷裂的DNA位點(diǎn)處的基因。

科學(xué)家們已知細(xì)胞有時(shí)利用供者DNA來(lái)修復(fù)細(xì)胞基因組中的斷裂。然而，這種供者DNA序列本身不會(huì)自我插入到細(xì)胞基因組中的空白位點(diǎn)上。相反，這種供者DNA的每個(gè)末端都存在著一種同源臂（homology arm）以便封閉這種切割造成的空隙。

這些同源臂由與遺傳密碼匹配的DNA的完整部分重疊的核苷酸組成。這有助這種供者DNA“粘附到”完整的DNA上。

然而，鑒于供者DNA需要比較長(zhǎng)的同源臂（特別是當(dāng)插入較長(zhǎng)的DNA序列、單鏈DNA或環(huán)狀DNA時(shí)，而且也很難制備出較長(zhǎng)的單鏈DNA和環(huán)狀DNA），科學(xué)家們認(rèn)為利用供者DNA修復(fù)DNA斷裂是一種低效的方法。隨著科學(xué)家們?cè)贑RISPR方面積累了更多的經(jīng)驗(yàn)，關(guān)于供者DNA的**設(shè)計(jì)規(guī)則和供者DNA的同源臂長(zhǎng)度的問(wèn)題就出現(xiàn)了。

為了解答這些問(wèn)題，在一項(xiàng)新的研究中，來(lái)自美國(guó)約翰霍普金斯大學(xué)的研究人員將不同的供者DNA組合插入到人胚胎腎細(xì)胞中，這些細(xì)胞以其生長(zhǎng)良好的能力和經(jīng)常用于癌癥研究中而為人所知。他們使用攜帶著編碼一種綠色熒光蛋白的基因的供者DNA，當(dāng)這種基因成功地插入到細(xì)胞基因組中時(shí)，這種綠色熒光蛋白就會(huì)在細(xì)胞的核膜上發(fā)出綠色熒光。相關(guān)研究結(jié)果于2017年11月27日在線發(fā)表在PNAS期刊上，論文標(biāo)題為“Precision genome editing using synthesis-dependent repair of Cas9-induced DNA breaks”。

約翰霍普金斯大學(xué)助理研究員Alexandre Paix發(fā)現(xiàn)線性DNA片段非常適合作為供者DNA，而且它們?cè)谌思?xì)胞中編輯DNA的效率比環(huán)狀DNA（這里指質(zhì)粒）高2～5倍。Paix說(shuō)，“線性DNA在實(shí)驗(yàn)室中很容易通過(guò)PCR擴(kuò)增法加以制備。”

Paix也測(cè)試了不同長(zhǎng)度的同源臂。他發(fā)現(xiàn)**的同源臂長(zhǎng)度大約為35個(gè)核苷酸（35nt），比科學(xué)家們通常使用的要短得多。

具體而言，這些研究人員發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)度為33～38nt的同源臂與長(zhǎng)度為518nt的同源臂具有相同的編輯成功率，在**條件下產(chǎn)生10％～20％的編輯成功率。相反之下，當(dāng)他們利用長(zhǎng)度為15～16nt的同源臂進(jìn)行測(cè)試時(shí)，這種基因插入成功率下降了一半。他們?cè)谌嘶蚪M的三個(gè)不同的位點(diǎn)上重復(fù)了這些結(jié)果。他們還發(fā)現(xiàn)新插入的DNA序列能夠長(zhǎng)達(dá)1000nt（不包括同源臂）。

這些研究人員利用長(zhǎng)度為57～993nt的供者DNA序列取得的編輯成功率在10%～50%。更短的供者DNA要比更長(zhǎng)的供者DNA取得更高的編輯成功率。比如，長(zhǎng)57nt的供者DNA、長(zhǎng)714nt的供者DNA和長(zhǎng)993nt的供者DNA插入到細(xì)胞基因組靶位點(diǎn)上的成功率分別為45.5%、23.5%和17.9%。當(dāng)長(zhǎng)度超過(guò)1000nt時(shí)，長(zhǎng)1122nt的供者DNA和長(zhǎng)2229nt的供者DNA具有非常低的插入成功率---大約為0.5%。

約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究副主任Geraldine Seydoux博士說(shuō)，“在序列長(zhǎng)度比較大時(shí)，導(dǎo)入編輯所需的供者DNA數(shù)量是非常困難的。細(xì)胞往往會(huì)因具有這么多的DNA而窒息。”

最后，這些研究人員還發(fā)現(xiàn)當(dāng)供者DNA距離CRISPR/Cas9切割位點(diǎn)不到30nt時(shí)，編輯成功率達(dá)到最高。Seydoux說(shuō)，“當(dāng)這種距離超過(guò)30nt時(shí)，這種插入是不可行的。”

Seydoux補(bǔ)充道，“這些參數(shù)應(yīng)當(dāng)能夠適用于科學(xué)家們?cè)噲D編輯的大多數(shù)基因。事實(shí)上，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)涉及對(duì)距離CRISPR切割位點(diǎn)僅兩到三個(gè)核苷酸的位置進(jìn)行編輯。”

這些研究人員也測(cè)試了這種方法是否能夠在小鼠胚胎中發(fā)揮作用。通過(guò)使用具有長(zhǎng)36nt的同源臂的PCR擴(kuò)增片段，他們?cè)?7種小鼠胚胎中，成功地將一種長(zhǎng)739nt的DNA序列（編碼一種綠色熒光蛋白）插入到27種小鼠胚胎中。

這些研究人員已正在利用這些修復(fù)規(guī)則來(lái)研究秀麗隱桿線蟲(chóng)中的DNA，而且他們正在研究這些修復(fù)規(guī)則是否也適用于其他類型的人細(xì)胞。

Seydoux說(shuō)，在這些修復(fù)規(guī)則被廣泛采用之前，它們應(yīng)當(dāng)在更多的人細(xì)胞類型和其他的有機(jī)體中接受測(cè)試。