細(xì)胞培養(yǎng)之貼壁細(xì)胞培養(yǎng)流程

細(xì)胞復(fù)蘇:

1.準(zhǔn)備工作乍:水浴鍋37%℃ 預(yù)熱，15ml離心管預(yù)先加3~5ml培養(yǎng)基1.從-80℃ 取出細(xì)胞，套在海綿漂中，在預(yù)熱的水浴鍋中震蕩溶解(37℃，溶解時(shí)間**小于lmin，凍存管內(nèi)仍有少許冰為傳)

2.將細(xì)胞液吸入預(yù)先加入培養(yǎng)基的15ml離心管，1500rpm，5min離心(注意配平)

注:也可+PBS重懸后再次離心(為了洗掉殘留凍存液)

3. 1ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，根據(jù)離心的細(xì)胞量選擇適合的皿，接種到血里，補(bǔ)體系(中迎3ml，大皿7ml)

4. 十字搖勻后顯微鏡觀察，放入培養(yǎng)箱。

細(xì)胞換液:

1.棄掉舊培養(yǎng)基，加PBS洗一遍(1-3ml都可)2.奔掉PBS，加培養(yǎng)基，體系同上。

細(xì)胞傳代:1.棄掉舊的培養(yǎng)基，PBS洗一遍，棄掉PBS2.加|ml或500ul胰酶(一般覆蓋細(xì)胞即可)，培養(yǎng)箱培養(yǎng)3min(不同細(xì)胞時(shí)間不同，需要摸索)。

3.用1ml槍吹打，觀察細(xì)胞是否能吹掉，若可以則加乙倍培養(yǎng)基中和后繼續(xù)吹打，吹落后移入15ml離心管離心，若不可以則再孵育一段時(shí)間后再次吹打。也可每隔1分鐘鏡下觀察細(xì)胞是否變圓，記錄**消化時(shí)間，以備下次使用。

4.1500rpm，5min離心，用3ml培養(yǎng)基重懸(培養(yǎng)基體系根據(jù)自己情況而定)。

5. 接種到血里(傳代比一般為1=2~1=3)，放入培養(yǎng)箱

細(xì)胞凍存:離心前步驟同傳代，離心后用1ml凍存液+500ul血清混后，重懸細(xì)胞移入凍存管，貼上封口膜，放入-80℃ 冰箱凍存。

計(jì)數(shù):離心后，1ml重懸，取100或10ul細(xì)胞懸液+900或90ulPBS進(jìn)行稀釋(相當(dāng)于稀釋10倍)，取10ul打入計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

注意事項(xiàng)

1.水浴鍋提前預(yù)熱

.離心時(shí)注意配平

3.一般生長(zhǎng)穩(wěn)定的細(xì)胞2-3天換液一次，生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞可3-4天換液一次。(具體情況具體分析)

觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底的80-90%，應(yīng)及時(shí)傳代。

觀察細(xì)胞形態(tài)變化，細(xì)胞透明度大、折光性強(qiáng)、輪廓清晰為佳。

4.為細(xì)胞換液時(shí)，要沿著培養(yǎng)瓶的一側(cè)輕輕地加入，而不是直接加到細(xì)胞中，以免損傷細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞株較為脆弱時(shí)尤其需要注意。