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支原體常規(guī)檢測方法匯總（四）

2021-11-26 16:57來源：威正翔禹|締一生物

大家晚上好！


不知不覺

細(xì)胞培養(yǎng)過程中支原體檢測內(nèi)容

已經(jīng)更新到第四期了

回顧一下知識點


被廣泛使用的方法

基于Venor?Gem qEP經(jīng)典法試劑盒的qPCR檢測法，目前使用較為廣泛，擁有高特異性、高靈敏度等特點，還可以選配支原體和細(xì)菌DNA、支原體絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品，來進(jìn)行特異性驗證、定量檢測。

經(jīng)典法pro版

基于Venor?Gem qOneStep一步法試劑盒的qPCR檢測法，是經(jīng)典法的升級版本，包含經(jīng)典法所有優(yōu)點。另外，內(nèi)控已配置好，更加省時省力。

傳統(tǒng)認(rèn)為的金標(biāo)準(zhǔn)

分離培養(yǎng)法被認(rèn)為是支原體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確率比較高，但培養(yǎng)周期長，而且對于一些特定支原體無法培養(yǎng)。

操作步驟多但簡單

DNA染色法檢測支原體雖然操作步驟較多，包含指示細(xì)胞培養(yǎng)，上清液共培養(yǎng)、染色等多個過程，但并不復(fù)雜，對技術(shù)要求相對沒有那么高。


今天我們就來介紹最后兩種常見檢測法

ELISA法和PCR法

廢話不多說

我們直接上干貨


                                   


ELISA法


首先我們先來簡單了解一下ELISA：


酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，簡寫ELISA或ELASA）指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。根據(jù)免疫吸附劑、酶聯(lián)物、結(jié)合物這些試劑的來源、樣本情況，檢測具體條件，可以分為夾心法、競爭法、間接法等不同類型。


支原體檢測過程中用到的ELISA，一般采用的是夾心法，針對支原體16S rRNA基因的帶標(biāo)記探針或抗體，來檢測培養(yǎng)物中是否含有支原體。


先用純化過的支原體抗體包被微孔板，制成固相抗體。

?

往微孔板中依次加入支原體（Mycoplasmal），再與 HRP（一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結(jié)合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物）標(biāo)記的支原體抗體結(jié)合，形成抗體 -抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。

?

經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB顯色。TMB在 HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色。


最后用酶標(biāo)儀分析結(jié)果：


顏色的深淺和樣品中的支原體（ Mycoplasmal）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm波長下測定吸光度（ OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中支原體濃度。整個過程時間比較短，一般三四個小時就能出結(jié)果。


整個過程除取樣外，還包括標(biāo)準(zhǔn)品稀釋、加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止、結(jié)果分析，步驟比較多，且很多步驟都需要有一定經(jīng)驗的人操作才能保證準(zhǔn)確性，因此對技術(shù)要求比較高。


另外，由于依賴抗體的特性，該方法能夠檢測的支原體種類比較有限，對于沒有抗體的支原體，ELISA就無能為力了。


PCR法


常規(guī)PCR法：


根據(jù)支原體核糖體16s-23s rRNA的特異保守序列設(shè)計引物，對待檢樣本DNA進(jìn)行擴增，通過對擴增產(chǎn)物的大小分析作出判斷。


以Venor?Gem OneStep支原體常規(guī)PCR檢測試劑盒為例，簡單介紹一下實驗流程。


樣本處理

與qPCR類似

取適量待檢測樣品上清

95℃孵育10min

以對樣品進(jìn)行穩(wěn)定化處理

試劑制備

離心?按比例混合?靜置?混勻


PCR體系建立

設(shè)置好陰性對照、陽性對照、重復(fù)孔

扣緊蓋子混勻


啟動PCR反應(yīng)

根據(jù)使用說明設(shè)置好程序


電泳結(jié)果分析



191bp為內(nèi)控對照條帶，表明PCR反應(yīng)正常。


當(dāng)樣本存在支原體污染時，由于內(nèi)控對照與支原體DNA存在競爭，內(nèi)控對照條帶變?nèi)?/span>（例如支原體DNA＞1000拷貝）。


陽性對照中支原體DNA＞10000拷貝，內(nèi)控對照條帶會完全消失。


可能在80-90bp存在引物自退火形成的條帶，此條帶不影響檢測結(jié)果。


如果待測樣本對PCR產(chǎn)生抑制，則內(nèi)控對照條帶變?nèi)?span style="margin:0px;padding:0px;outline:0px;max-width:100%;box-sizing:border-box;overflow-wrap:break-word !important;font-size:14px;color:#A0A0A0;">（和陰性對照相比），此時應(yīng)先進(jìn)行DNA抽提（推薦使用：Venor? Gem Sample Preparation Kit 支原體DNA抽提試劑盒），然后再檢測。



常規(guī)PCR的優(yōu)點就是檢測時間短：2-3小時即可出結(jié)果、靈敏度高、特異性強、操作簡單。


缺點也很明顯，用PCR檢測已經(jīng)進(jìn)行過支原體滅活的樣品時，由于支原體DNA依然存在，所以此時PCR結(jié)果仍為陽性，說明該樣品曾經(jīng)感染過支原體。


另外不同廠家的試劑盒差異比較大，需要謹(jǐn)慎選擇。


ELISA法


至此，幾種常規(guī)的檢測方法都已經(jīng)介紹給大家啦，給大家做了個小總結(jié)，供參考。有些單一的檢測方法并不嚴(yán)謹(jǐn)，需要結(jié)合實驗情況，聯(lián)合使用多種方法進(jìn)行檢驗，確保結(jié)果的可信度。


培養(yǎng)法是金標(biāo)準(zhǔn)，但是周期長，有些支原體還檢測不到；

染色法普適性強，操作簡單，但是對于支原體數(shù)量有要求，也容易有假陽性假陰性；

ELISA法耗時短，但是對操作人員要求比較高，需要獲得相應(yīng)抗體才可以進(jìn)行試驗；

常規(guī)PCR法，基本包含了上面所有的優(yōu)點，但是不能分辨支原體的死活，用到的試劑盒也是良莠不齊；

qPCR法，涵蓋上述所有優(yōu)點，但是對實驗人員有一定的經(jīng)驗要求，因此該方法目前也是十分常用的檢測手段。



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