產(chǎn)品目錄
  • 細胞培養(yǎng)進口血清
    進口胎牛血清
    進口新生牛血清
    進口豬血清
    馬血清
  • 支原體檢測盒及標準品
    常規(guī)PCR檢測試劑盒
    熒光定量PCR檢測（qPCR法）
    支原體DNA提取
    靈敏度標準品（方法驗證用）
    特異性標準品（方法驗證用）
    PCR定量標準品（可用于方法驗證）
  • 支原體祛除試劑
    細胞中支原體祛除
    環(huán)境支原體祛除
    水槽支原體祛除
  • 干細胞培養(yǎng)基
  • DNA/RNA污染祛除
    DNA/RNA污染祛除試劑
    DNA污染監(jiān)測
  • RNA病毒研究試劑
    RNA病毒檢測試劑盒
    病毒RNA提取
  • PCR儀器及配套產(chǎn)品
    DNA污染監(jiān)測祛除
    PCR/qPCR儀性能檢查
    PCR試劑
    PCR試劑盒
    PCR預(yù)混液（凍干粉）
    熱啟動聚合酶MB Taq DNA
  • 微生物PCR檢測
    食品檢測類產(chǎn)品
    食品微生物檢測
    細菌PCR檢測
歡迎來到 威正翔禹|締一生物官方網(wǎng)站|咨詢熱線：400-166-8600
咨詢熱線
400-166-8600

產(chǎn)品目錄
  • 細胞培養(yǎng)進口血清
    進口胎牛血清
    進口新生牛血清
    進口豬血清
    馬血清
  • 支原體檢測盒及標準品
    常規(guī)PCR檢測試劑盒
    熒光定量PCR檢測（qPCR法）
    支原體DNA提取
    靈敏度標準品（方法驗證用）
    特異性標準品（方法驗證用）
    PCR定量標準品（可用于方法驗證）
  • 支原體祛除試劑
    細胞中支原體祛除
    環(huán)境支原體祛除
    水槽支原體祛除
  • 干細胞培養(yǎng)基
  • DNA/RNA污染祛除
    DNA/RNA污染祛除試劑
    DNA污染監(jiān)測
  • RNA病毒研究試劑
    RNA病毒檢測試劑盒
    病毒RNA提取
  • PCR儀器及配套產(chǎn)品
    DNA污染監(jiān)測祛除
    PCR/qPCR儀性能檢查
    PCR試劑
    PCR試劑盒
    PCR預(yù)混液（凍干粉）
    熱啟動聚合酶MB Taq DNA
  • 微生物PCR檢測
    食品檢測類產(chǎn)品
    食品微生物檢測
    細菌PCR檢測

支原體常規(guī)檢測方法匯總（三）

2021-11-24 15:43來源：威正翔禹|締一生物

大家晚上好！


細胞培養(yǎng)過程中支原體檢測方法如約而至

第三期來啦！


             


還沒有看前兩期內(nèi)容的小伙伴

可以點擊下方傳送門


支原體常規(guī)檢測方法匯總（一）

支原體常規(guī)檢測方法匯總（二）


上回書和上上回書說道

qPCR檢測法是一種目前比較常用

效果也比較可靠的方法


那除了qPCR

還有沒有其他方法可以檢測呢？

                         


所以今天就來講講

分離培養(yǎng)法和DNA染色法

有請兩位主角閃亮登場



01

分離培養(yǎng)法


簡單來說，這種方法的基本原理就是：


分離，然后培養(yǎng)


                               

聽君一席話如聽一席話


展開來講，就是從可疑的細胞培養(yǎng)體系中取樣，接種到適宜支原體生長的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會在這種瓊脂平板上瘋狂生長，最終形成明顯可見的特征性菌落。


操作規(guī)范的情況下，這種方法很少會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，檢測精確度很高，因此被譽為支原體檢測金標準。


缺點就是檢測時間太長，支原體要長出明顯克隆至少需要4周時間。另一方面，盡管可以檢測絕大多數(shù)支原體種類，分離培養(yǎng)法也有力所不及的時候，例如支原體M. Hyorhinis。因此，該方法能鑒定的支原體種類有限，成為它的另一個缺點。


02

DNA染色法


該方法的實驗思路是：


培養(yǎng)指示細胞

?

樣品上清液收集

?

上清液接種

?

染色觀察結(jié)果


這一波操作看起來有點復雜，那展開說說：


將供試品接種于指示細胞（無污染的Vero 細胞或經(jīng)國家藥品檢定機構(gòu)認可的其他細胞，供試品應(yīng)對該細胞生長無影響。下面以Vero細胞為例）中培養(yǎng)后，用特異熒光染料（如Hoechst 33258）染色，支原體中的核酸也可以被著色，因此，如果待檢測細胞中含有支原體，那么就會導致指示細胞被感染，進而在細胞膜或培養(yǎng)基等處發(fā)現(xiàn)藍色熒光（支原體附著在細胞膜上，也有可能游離在細胞培養(yǎng)基中）。


指示細胞培養(yǎng)：將指示細胞復蘇、傳代，調(diào)整至**狀態(tài)，留出適宜的量備用。

樣品上清液收集：無抗生素培養(yǎng)基中加入待檢測樣品后，細胞需至少傳一代，然后取細胞已長滿且3 天未換液的細胞培養(yǎng)上清液待檢。（為了對待檢測樣品中的支原體進行富集）

上清液接種：在制備好的指示細胞培養(yǎng)板中加入一定量的待檢細胞培養(yǎng)上清，36°C培養(yǎng)3-5 天。指示細胞培養(yǎng)物至少傳代1 次，末次傳代培養(yǎng)可用6孔板培養(yǎng)3-5 天。

染色觀察：吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，加入固定液，放置5分鐘。吸出固定液后進行10min的二次固定，再次吸出固定液，使蓋玻片在空氣中干燥。加DNA 染料工作液5ml，加蓋，室溫放置30分鐘，漂洗3次，干燥，封片。用熒光顯微鏡觀察。


熒光顯微鏡下可見細胞表面或培養(yǎng)基中，有大小不等、不規(guī)則的藍色熒光著色顆粒，則說明有可能存在支原體污染。



對于DNA染色法方法，優(yōu)缺點也是很明顯的：


優(yōu)點：


1、適用于一些不易培養(yǎng)的支原體，如豬鼻支原體，分離培養(yǎng)法對該支原體檢測并不可靠，但可用DNA染色法準確地檢測出來。


2、操作步驟雖然多，但都相對簡單


3、靈敏度尚可。


缺點：


1、時間較長，從Vero細胞復蘇、傳代，再到收集上清后再次培養(yǎng)，有時甚至需要十幾天時間

2、存在假陽性和假陰性的可能：如一些死亡細胞釋放出來的DNA會被染成藍色，出現(xiàn)假陽性；或是由于熒光過若而出現(xiàn)假陰性使結(jié)果出現(xiàn)偏差，因此使用這個方法需要一定的經(jīng)驗。


今天的兩種方法就介紹到這里啦，如果對支原體檢測感興趣，也可以點擊文末的閱讀原文，了解更多詳情！


如果你對本公司產(chǎn)品感興趣，想要了解更多，歡迎訪問

北京締一生物官網(wǎng)：www.dyshengwu.com

或聯(lián)系北京締一生物公司

咨詢熱線：

400-166-8600

010-84118494

021-64186645

13811167915

咨詢QQ: 1580434811

咨詢QQ: 1258888686

客服郵箱：servicebj@viansaga.com

客服郵箱：servicesh@viansaga.com



聲明：本網(wǎng)站所有注明“來源：締一生物”的內(nèi)容，版權(quán)均屬于北京締一生物網(wǎng)站所有，受到知識產(chǎn)權(quán)的法律保護。如需引用、轉(zhuǎn)載，須注明來源及原文鏈接。如內(nèi)容涉及實質(zhì)性修改，須來電獲取書面授權(quán)，且轉(zhuǎn)載時，須注明“來源：締一生物”。

最終解釋權(quán)歸締一生物所有。