產(chǎn)品目錄
  • 細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)口血清
    進(jìn)口胎牛血清
    進(jìn)口新生牛血清
    進(jìn)口豬血清
    馬血清
  • 支原體檢測(cè)盒及標(biāo)準(zhǔn)品
    常規(guī)PCR檢測(cè)試劑盒
    熒光定量PCR檢測(cè)（qPCR法）
    支原體DNA提取
    靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品（方法驗(yàn)證用）
    特異性標(biāo)準(zhǔn)品（方法驗(yàn)證用）
    PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品（可用于方法驗(yàn)證）
  • 支原體祛除試劑
    細(xì)胞中支原體祛除
    環(huán)境支原體祛除
    水槽支原體祛除
  • 干細(xì)胞培養(yǎng)基
  • DNA/RNA污染祛除
    DNA/RNA污染祛除試劑
    DNA污染監(jiān)測(cè)
  • RNA病毒研究試劑
    RNA病毒檢測(cè)試劑盒
    病毒RNA提取
  • PCR儀器及配套產(chǎn)品
    DNA污染監(jiān)測(cè)祛除
    PCR/qPCR儀性能檢查
    PCR試劑
    PCR試劑盒
    PCR預(yù)混液（凍干粉）
    熱啟動(dòng)聚合酶MB Taq DNA
  • 微生物PCR檢測(cè)
    食品檢測(cè)類產(chǎn)品
    食品微生物檢測(cè)
    細(xì)菌PCR檢測(cè)
歡迎來到 威正翔禹|締一生物官方網(wǎng)站|咨詢熱線：400-166-8600
咨詢熱線
400-166-8600

產(chǎn)品目錄
  • 細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)口血清
    進(jìn)口胎牛血清
    進(jìn)口新生牛血清
    進(jìn)口豬血清
    馬血清
  • 支原體檢測(cè)盒及標(biāo)準(zhǔn)品
    常規(guī)PCR檢測(cè)試劑盒
    熒光定量PCR檢測(cè)（qPCR法）
    支原體DNA提取
    靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品（方法驗(yàn)證用）
    特異性標(biāo)準(zhǔn)品（方法驗(yàn)證用）
    PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品（可用于方法驗(yàn)證）
  • 支原體祛除試劑
    細(xì)胞中支原體祛除
    環(huán)境支原體祛除
    水槽支原體祛除
  • 干細(xì)胞培養(yǎng)基
  • DNA/RNA污染祛除
    DNA/RNA污染祛除試劑
    DNA污染監(jiān)測(cè)
  • RNA病毒研究試劑
    RNA病毒檢測(cè)試劑盒
    病毒RNA提取
  • PCR儀器及配套產(chǎn)品
    DNA污染監(jiān)測(cè)祛除
    PCR/qPCR儀性能檢查
    PCR試劑
    PCR試劑盒
    PCR預(yù)混液（凍干粉）
    熱啟動(dòng)聚合酶MB Taq DNA
  • 微生物PCR檢測(cè)
    食品檢測(cè)類產(chǎn)品
    食品微生物檢測(cè)
    細(xì)菌PCR檢測(cè)

支原體常規(guī)檢測(cè)方法匯總（四）

2021-11-26 16:57來源：威正翔禹|締一生物

大家晚上好！


不知不覺

細(xì)胞培養(yǎng)過程中支原體檢測(cè)內(nèi)容

已經(jīng)更新到第四期了

回顧一下知識(shí)點(diǎn)


被廣泛使用的方法

基于Venor?Gem qEP經(jīng)典法試劑盒的qPCR檢測(cè)法，目前使用較為廣泛，擁有高特異性、高靈敏度等特點(diǎn)，還可以選配支原體和細(xì)菌DNA、支原體絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品，來進(jìn)行特異性驗(yàn)證、定量檢測(cè)。

經(jīng)典法pro版

基于Venor?Gem qOneStep一步法試劑盒的qPCR檢測(cè)法，是經(jīng)典法的升級(jí)版本，包含經(jīng)典法所有優(yōu)點(diǎn)。另外，內(nèi)控已配置好，更加省時(shí)省力。

傳統(tǒng)認(rèn)為的金標(biāo)準(zhǔn)

分離培養(yǎng)法被認(rèn)為是支原體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確率比較高，但培養(yǎng)周期長(zhǎng)，而且對(duì)于一些特定支原體無法培養(yǎng)。

操作步驟多但簡(jiǎn)單

DNA染色法檢測(cè)支原體雖然操作步驟較多，包含指示細(xì)胞培養(yǎng)，上清液共培養(yǎng)、染色等多個(gè)過程，但并不復(fù)雜，對(duì)技術(shù)要求相對(duì)沒有那么高。


今天我們就來介紹最后兩種常見檢測(cè)法

ELISA法和PCR法

廢話不多說

我們直接上干貨


                                   


ELISA法


首先我們先來簡(jiǎn)單了解一下ELISA：


酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)寫ELISA或ELASA）指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法。根據(jù)免疫吸附劑、酶聯(lián)物、結(jié)合物這些試劑的來源、樣本情況，檢測(cè)具體條件，可以分為夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、間接法等不同類型。


支原體檢測(cè)過程中用到的ELISA，一般采用的是夾心法，針對(duì)支原體16S rRNA基因的帶標(biāo)記探針或抗體，來檢測(cè)培養(yǎng)物中是否含有支原體。


先用純化過的支原體抗體包被微孔板，制成固相抗體。

?

往微孔板中依次加入支原體（Mycoplasmal），再與 HRP（一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jià)結(jié)合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物）標(biāo)記的支原體抗體結(jié)合，形成抗體 -抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。

?

經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB顯色。TMB在 HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色。


最后用酶標(biāo)儀分析結(jié)果：


顏色的深淺和樣品中的支原體（ Mycoplasmal）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（ OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中支原體濃度。整個(gè)過程時(shí)間比較短，一般三四個(gè)小時(shí)就能出結(jié)果。


整個(gè)過程除取樣外，還包括標(biāo)準(zhǔn)品稀釋、加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止、結(jié)果分析，步驟比較多，且很多步驟都需要有一定經(jīng)驗(yàn)的人操作才能保證準(zhǔn)確性，因此對(duì)技術(shù)要求比較高。


另外，由于依賴抗體的特性，該方法能夠檢測(cè)的支原體種類比較有限，對(duì)于沒有抗體的支原體，ELISA就無能為力了。


PCR法


常規(guī)PCR法：


根據(jù)支原體核糖體16s-23s rRNA的特異保守序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)待檢樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小分析作出判斷。


以Venor?Gem OneStep支原體常規(guī)PCR檢測(cè)試劑盒為例，簡(jiǎn)單介紹一下實(shí)驗(yàn)流程。


樣本處理

與qPCR類似

取適量待檢測(cè)樣品上清

95℃孵育10min

以對(duì)樣品進(jìn)行穩(wěn)定化處理

試劑制備

離心?按比例混合?靜置?混勻


PCR體系建立

設(shè)置好陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、重復(fù)孔

扣緊蓋子混勻


啟動(dòng)PCR反應(yīng)

根據(jù)使用說明設(shè)置好程序


電泳結(jié)果分析



191bp為內(nèi)控對(duì)照條帶，表明PCR反應(yīng)正常。


當(dāng)樣本存在支原體污染時(shí)，由于內(nèi)控對(duì)照與支原體DNA存在競(jìng)爭(zhēng)，內(nèi)控對(duì)照條帶變?nèi)?/span>（例如支原體DNA＞1000拷貝）。


陽性對(duì)照中支原體DNA＞10000拷貝，內(nèi)控對(duì)照條帶會(huì)完全消失。


可能在80-90bp存在引物自退火形成的條帶，此條帶不影響檢測(cè)結(jié)果。


如果待測(cè)樣本對(duì)PCR產(chǎn)生抑制，則內(nèi)控對(duì)照條帶變?nèi)?span style="margin:0px;padding:0px;outline:0px;max-width:100%;box-sizing:border-box;overflow-wrap:break-word !important;font-size:14px;color:#A0A0A0;">（和陰性對(duì)照相比），此時(shí)應(yīng)先進(jìn)行DNA抽提（推薦使用：Venor? Gem Sample Preparation Kit 支原體DNA抽提試劑盒），然后再檢測(cè)。



常規(guī)PCR的優(yōu)點(diǎn)就是檢測(cè)時(shí)間短：2-3小時(shí)即可出結(jié)果、靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單。


缺點(diǎn)也很明顯，用PCR檢測(cè)已經(jīng)進(jìn)行過支原體滅活的樣品時(shí)，由于支原體DNA依然存在，所以此時(shí)PCR結(jié)果仍為陽性，說明該樣品曾經(jīng)感染過支原體。


另外不同廠家的試劑盒差異比較大，需要謹(jǐn)慎選擇。


ELISA法


至此，幾種常規(guī)的檢測(cè)方法都已經(jīng)介紹給大家啦，給大家做了個(gè)小總結(jié)，供參考。有些單一的檢測(cè)方法并不嚴(yán)謹(jǐn)，需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)情況，聯(lián)合使用多種方法進(jìn)行檢驗(yàn)，確保結(jié)果的可信度。


培養(yǎng)法是金標(biāo)準(zhǔn)，但是周期長(zhǎng)，有些支原體還檢測(cè)不到；

染色法普適性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，但是對(duì)于支原體數(shù)量有要求，也容易有假陽性假陰性；

ELISA法耗時(shí)短，但是對(duì)操作人員要求比較高，需要獲得相應(yīng)抗體才可以進(jìn)行試驗(yàn)；

常規(guī)PCR法，基本包含了上面所有的優(yōu)點(diǎn)，但是不能分辨支原體的死活，用到的試劑盒也是良莠不齊；

qPCR法，涵蓋上述所有優(yōu)點(diǎn)，但是對(duì)實(shí)驗(yàn)人員有一定的經(jīng)驗(yàn)要求，因此該方法目前也是十分常用的檢測(cè)手段。



如果你對(duì)本公司產(chǎn)品感興趣，想要了解更多，歡迎訪問

北京締一生物官網(wǎng)：www.dyshengwu.com

或聯(lián)系北京締一生物公司

咨詢熱線：

400-166-8600

010-84118494

021-64186645

13811167915

咨詢QQ: 1580434811

咨詢QQ: 1258888686

客服郵箱：servicebj@viansaga.com

客服郵箱：servicesh@viansaga.com



聲明：本網(wǎng)站所有注明“來源：締一生物”的內(nèi)容，版權(quán)均屬于北京締一生物網(wǎng)站所有，受到知識(shí)產(chǎn)權(quán)的法律保護(hù)。如需引用、轉(zhuǎn)載，須注明來源及原文鏈接。如內(nèi)容涉及實(shí)質(zhì)性修改，須來電獲取書面授權(quán)，且轉(zhuǎn)載時(shí)，須注明“來源：締一生物”。

最終解釋權(quán)歸締一生物所有。