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內(nèi)毒素對細(xì)胞的危害到底有多大？

2021-10-26 09:18來源：威正翔禹|締一生物

我們常說，細(xì)胞培養(yǎng)過程中，在選購血清的時候，一定要看檢測報告，關(guān)注上面一些很重要的指標(biāo)。比如病毒、內(nèi)毒素這些。


不難理解，血清中如果有病毒存在，不僅細(xì)胞養(yǎng)不好，實驗人員的安全也會受到威脅。


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那這血清中內(nèi)毒素的高低對細(xì)胞培養(yǎng)會有啥影響啊？為什么選血清要選內(nèi)毒素含量低的呢？


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所以今天我們就來聊聊，細(xì)胞培養(yǎng)中血清的內(nèi)毒素問題。



內(nèi)毒素是個啥？


內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，叫做脂多糖。脂多糖對宿主是有毒性的。內(nèi)毒素只有當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞后才釋放出來，所以叫做內(nèi)毒素。

人體對細(xì)菌內(nèi)毒素極為敏感。


極微量（1-5ng/kg，而1ng≈2.5EU）內(nèi)毒素就能引起體溫上升，發(fā)熱反應(yīng)持續(xù)約4小時后逐漸消退。


自然感染時，因革蘭氏陰性菌不斷生長繁殖，同時伴有陸續(xù)死亡、釋出內(nèi)毒素，故發(fā)熱反應(yīng)將持續(xù)至體內(nèi)病原菌完全消滅為止。


微信圖片_20211026092012.jpg


內(nèi)毒素引起發(fā)熱反應(yīng)的原因是內(nèi)毒素作用于體內(nèi)的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，使之產(chǎn)生IL-1、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子作用于宿主下丘腦的體溫調(diào)節(jié)中樞，促使體溫升高發(fā)熱。

由于內(nèi)毒素是細(xì)菌死亡裂解或自溶引起的，因此環(huán)境中大量存在內(nèi)毒素。但是如果在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，出現(xiàn)了大量內(nèi)毒素，可不是一件好事。



內(nèi)毒素對細(xì)胞有啥影響？


此前，有人做過實驗，來觀察內(nèi)毒素對細(xì)胞培養(yǎng)的影響，記錄的影響包括：刺激白細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生組織因子、激活鼠巨噬細(xì)胞，以及通過極低水平（低于 1 ng/mL）的內(nèi)毒素抑制鼠類紅細(xì)胞集落形成等一系列指標(biāo)。


隨后，發(fā)表了許多關(guān)于內(nèi)毒素對體外細(xì)胞功能和生長影響的論文。


細(xì)胞種類

濃度(ng/mL)

內(nèi)毒素的效應(yīng)

馬巨噬細(xì)胞

0.5

誘導(dǎo)產(chǎn)生 IL-6

人體外受精胚胎細(xì)胞

1

體外受精成功率降低了 3-4 倍

主動脈內(nèi)皮細(xì)胞

10

硫酸肝素蛋白聚糖出現(xiàn)劑量依賴性改變

鼠 B 淋巴瘤

10

免疫球蛋白輕鏈的產(chǎn)量增加 30-40 倍

重組CHO細(xì)胞

10

改變蛋白質(zhì)生產(chǎn)

心肌細(xì)胞

10

誘發(fā)收縮功能障礙

人T細(xì)胞

100

在單核細(xì)胞存在下誘導(dǎo)增殖和淋巴因子產(chǎn)生

尿道上皮細(xì)胞

5000

改變克隆效率


Morris等人發(fā)現(xiàn)（1），只需暴露 6 小時，低至 0.5 ng/mL 的內(nèi)毒素水平可以顯著增加馬腹膜巨噬細(xì)胞中IL-6的產(chǎn)生。Mattern等人發(fā)現(xiàn)（2）， 100 ng/mL 內(nèi)毒素可以刺激人類 T 細(xì)胞的增殖及其淋巴因子的產(chǎn)生，但這種刺激需要與先前暴露于內(nèi)毒素的單核細(xì)胞直接物理接觸。Sibley等人報道，10 到 200 ng/mL 內(nèi)毒素刺激鼠 B 細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系 (70Z/3) 完成 IgM 的產(chǎn)生，然后在細(xì)胞表面表達(dá)（3）。


基于上述證據(jù)，很明顯，內(nèi)毒素對每種細(xì)胞的影響是不一樣。接下來我們就看看產(chǎn)生這些影響的機(jī)制有哪些。



內(nèi)毒素對細(xì)胞有啥影響？


關(guān)于內(nèi)毒素與細(xì)胞培養(yǎng)物相互作用的機(jī)制仍有很多未知（4，5，6，7）。



  有一些研究報道：


  • 在血清中發(fā)現(xiàn)了一種 60 kDa 的糖蛋白 LPS 結(jié)合蛋白 (LBP)，它通過脂質(zhì) A 結(jié)構(gòu)域與 LPS 結(jié)合，大大增強(qiáng)了與免疫系統(tǒng)細(xì)胞相互作用的能力。這種增強(qiáng)似乎需要特定的 55 kDa 糖蛋白受體來輔助配合。這種蛋白可以膜錨定再多種免疫細(xì)胞上，當(dāng)與 LPS-LBP 結(jié)合時，會啟動一系列事件，導(dǎo)致細(xì)胞因子 mRNA 的產(chǎn)生和隨后細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子，但細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)究竟是如何發(fā)生的尚不完全清楚。


  • LPS 也可能通過其他方式與細(xì)胞相互作用。一些缺乏 CD14 受體的細(xì)胞已被證明可以受到 LPS 的影響。LPS 可能通過未知受體、內(nèi)吞作用或直接進(jìn)入細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞 (16)。Risco 等人(8) 證明 LPS 可以與細(xì)胞骨架微管結(jié)合，并在高濃度下抑制微管聚合。這種結(jié)合是LPS 的某些細(xì)胞毒性作用的一種可能機(jī)制，但作用似乎不涉及細(xì)胞因子激活。



參考文獻(xiàn)：

1、Morris,D.D., Crowe, N., Moore, J.N.and Moldawer, L.L. Endotoxin-Induced Production ofInterleukin 6 by Equine Peritoneal Macrophages In Vitro. Am. J. Vet. Res.53:1298-1301 (1992).

2、Mattern, T.,Thanhauser, A., Reiling, N.,Toellner, K., Duchrow, M., Kusumoto, S.,Rietschel,E.T., Ernst, M., Brade, H.,Flad, H.D. and Ulmer, A.J. Endotoxin and Lipid A StimulateProliferation of Human T Cells In the Presence of Autologous Monocytes. J.Immunol. 153:2996-3004(1994).

3、Sibley, C.H.,Terry, A. and Raetz, C.R.H.Induction of K Light Chain Synthesis in 70Z/3 BLymphoma Cells by Chemically Defined Lipid A Precursors. J. Biol. Chem.263:5098-5103 (1988).

4、Morrison, D.C.,Dinarello, C.A., Munford,R.S., Natanson, C., Danner, R., Pollack,M., Spitzer,J.J., Ulevitch, R.J., Vogel,S.N., and McSweegan, E. Current Status of BacterialEndotoxins. ASM News,60:479-484 (1994).

5、Raetz, C.R.H.Biochemistry of Endotoxins.Annu. Rev. Biochem. 59:129-170 (1990).

6、Raetz,C.R.H. Bacterial Endotoxins:Extraordinary Lipids that Activate EucaryoticSignal Transduction. J. Bact.175:5745-5753 (1993).

7.、Raetz,C.R., Ulevitch, R.J., Wright, S.D.,Sibley, C.H., Ding, A., and Nathan, C.F. Gram-negativeEndotoxin: An Extraordinary Lipid with Profound Effects on Eukaryotic SignalTransduction. FASEB J. 5:2652-2660 (1991).

8、Risco, C.,Dominguez, J.E., Bosch, M.A.,and Carrascosa, J.L. Biochemical and

ElectronMicroscopy Analysis of the Endotoxin Binding to Microtubules in vitro. Mol.Cell. Biochem. 121:67-74(1993).


從現(xiàn)有的研究可以看出，內(nèi)毒素對于細(xì)胞培養(yǎng)影響還是很大的：


改變細(xì)胞外形

活化細(xì)胞，產(chǎn)生訊息傳遞物質(zhì)

抑制酶活性

抑制人工受精的成功率等


內(nèi)毒素過高，有事甚至?xí)苯痈淖兾覀兊膶嶒灲Y(jié)果。所以要盡量避免內(nèi)毒素的干擾。


一般來說，細(xì)胞或組織培養(yǎng)過程中內(nèi)毒素污染源通常來自于血清、培養(yǎng)液及外加藥物配制用水等。


所以選擇內(nèi)毒素含量低的血清就顯得尤為重要。


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