【支原體核酸法】用絕對定量標準品

目前，支原體核酸檢測法（常規PCR、熒光定量PCR）應用較為廣泛，尤其在生物制藥和細胞治療領域，可以替代傳統的培養法和DNA染色法。但同時，各種品牌的支原體PCR和qPCR檢測試劑盒又良莠不齊，因此，對核酸法本身進行方法學驗證是非常必要的。

國際上對支原體核酸法的驗證提出了三項要求：檢測限、特異性和耐用性。在檢測限方面，歐洲藥典除了規定要達到10CFU/ml或100CFU/ml外，也指出可以用等量的支原體核酸拷貝數來表示。這時就需要選用合適的支原體核酸標準品。

全球知名的微生物污染防控公司Minerva Biolabs（以下簡稱德國MB公司），專門提供包括歐洲/日本藥典指定9種支原體在內的PCR絕對定量標準品共14種，可進行10倍梯度稀釋，制備標準曲線，確定核酸法的檢測限，因而廣受全球藥廠的青睞。

德國MB公司提供的PCR絕對定量標準品信息如下：

德國MB公司提供的PCR絕對定量標準品信息如下：

一、試劑盒組分：

說明：2-8℃保存。使用前，標準品溶解后在-18℃以下保存。避免反復凍融。

、質控保證

微生物在液體培養基中培養，并在對數生長期末期收集。DNA用酚氯仿抽提，繼而用過濾柱純化。DNA純度用分光光度計法測量，保證OD260/280≥1.8。微生物物種用Sanger測序法確定。

純化DNA的定量采用小牛胸腺DNA標準品進行光密度測量，進而用熒光法證實。DNA最終稀釋，并調整為1×10⁸基因組拷貝/管。稀釋倍數用qPCR分析證實。

每個批號的產品均提供質控證明。

三、操作步驟：

1、標準品復溶

（1）所有管短時離心。

（2）加入100μl Tris緩沖液到帶綠蓋的管中。

（3）室溫靜置5分鐘。

（4）渦旋振蕩10秒，再離心5秒。

（5）使用適當體積的DNA溶液直接用于PCR或直接稀釋，用于制備DNA標準曲線

2、制備10倍稀釋的DNA標準曲線

（1）使標準品和Tris緩沖液室溫達到平衡。

（2）標記每個1.5ml離心管。每個管加入90ml Tris緩沖液。

（3）標準品混勻離心。

（4）標準品1：加10μl標準品母液到第1管，蓋蓋并混勻。簡要離心。

（5）標準品2：從第1管中取出10μl到第2管，蓋蓋并混勻。簡要離心。

（6）標準品3：從第2管中取出10μl到第3管，蓋蓋并混勻。簡要離心。

（7）下面的管均重復以上步驟。推薦制備6個標準品（梯度稀釋）。

3、PCR擴增

溶解的DNA可直接用于常規PCR。德國MB公司推薦Venor?GeM PCR試劑盒用于支原體檢測，或Onar?

Bacteria PCR試劑盒用于細胞培養中的細菌檢測。

對于qPCR，使用梯度稀釋的DNA標準品，可制備標準曲線。大多數qPCR軟件允許通過標準曲線進行定量分析。這依賴于正確的設置，包括標準曲線的參數。為便于正確定量，要確定你的標準曲線樣品。使用者可以試用下列參數用于設置。體積決定了每個PCR反應的基因組拷貝數。

4、評估

使用梯度稀釋，qPCR檢測后Ct值會隨著DNA濃度下降而升高。通過Ct值和DNA樣本量產生一條標準曲線，未知樣本的濃度通過標準曲線可以計算。下列的擴增曲線是用德國MB公司的Venor?

GeM qEP試劑盒繪制的。所用儀器為CFX96 Touch熒光定量PCR儀。

圖1. 梯度稀釋標準品的擴增曲線。標準品為發酵支原體的10⁶至10個基因組拷貝數。

圖2.用Bio-Rad CFX Manager軟件產生的標準曲線。

總之，PCR定量標準品可提供低拷貝數的DNA標準品，因而可精準確定核酸法的檢測限。而10CFU的靈敏度標準品只能觀察是否能達到這一閾值，而無法確定最終為多少。從這個角度說，PCR絕對定量標準品具有自己獨特的優勢。