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【支原體核酸法】用絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品

2020-08-19 13:45來源：威正翔禹|締一生物


目前，支原體核酸檢測法（常規(guī)PCR、熒光定量PCR）應(yīng)用較為廣泛，尤其在生物制藥和細胞治療領(lǐng)域，可以替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和DNA染色法。但同時，各種品牌的支原體PCR和qPCR檢測試劑盒又良莠不齊，因此，對核酸法本身進行方法學(xué)驗證是非常必要的。


國際上對支原體核酸法的驗證提出了三項要求：檢測限、特異性和耐用性。在檢測限方面，歐洲藥典除了規(guī)定要達到10CFU/ml或100CFU/ml外，也指出可以用等量的支原體核酸拷貝數(shù)來表示。這時就需要選用合適的支原體核酸標(biāo)準(zhǔn)品。


全球知名的微生物污染防控公司Minerva Biolabs（以下簡稱德國MB公司），專門提供包括歐洲/日本藥典指定9種支原體在內(nèi)的PCR絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品共14種，可進行10倍梯度稀釋，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定核酸法的檢測限，因而廣受全球藥廠的青睞。

德國MB公司提供的PCR絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品信息如下：

德國MB公司提供的PCR絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品信息如下：

PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品的物種

貨號

口腔支原體

52-0112

雞敗血支原體

52-0115

萊氏無膽甾原體

52-0116

發(fā)酵支原體

52-0117

肺炎支原體

52-0119

關(guān)節(jié)液支原體

52-0124

精氨酸支原體

52-0129

豬鼻支原體

52-0130

檸檬螺原體

52-0164

唾液支原體

52-0103

百日咳桿菌

52-5571

大腸埃希菌

52-0083

嗜肺軍團菌

52-0101

銅綠假單胞菌

52-0071




一、試劑盒組分：

試劑盒組分

數(shù)量

蓋子顏色

PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品

1×108基因組拷貝/管

1管凍干粉

綠色

Tris緩沖液，10mM Tris，pH8.5（用于溶解和稀釋標(biāo)準(zhǔn)品）

2ml×3管

白色


說明：2-8℃保存。使用前，標(biāo)準(zhǔn)品溶解后在-18℃以下保存。避免反復(fù)凍融。


、質(zhì)控保證


微生物在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在對數(shù)生長期末期收集。DNA用酚氯仿抽提，繼而用過濾柱純化。DNA純度用分光光度計法測量，保證OD260/280≥1.8。微生物物種用Sanger測序法確定。


純化DNA的定量采用小牛胸腺DNA標(biāo)準(zhǔn)品進行光密度測量，進而用熒光法證實。DNA最終稀釋，并調(diào)整為1×108基因組拷貝/管。稀釋倍數(shù)用qPCR分析證實。

每個批號的產(chǎn)品均提供質(zhì)控證明。

三、操作步驟：

1、標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶

（1）所有管短時離心。

（2）加入100μl Tris緩沖液到帶綠蓋的管中。

（3）室溫靜置5分鐘。

（4）渦旋振蕩10秒，再離心5秒。

（5）使用適當(dāng)體積的DNA溶液直接用于PCR或直接稀釋，用于制備DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2、制備10倍稀釋的DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

（1）使標(biāo)準(zhǔn)品和Tris緩沖液室溫達到平衡。

（2）標(biāo)記每個1.5ml離心管。每個管加入90ml Tris緩沖液。

（3）標(biāo)準(zhǔn)品混勻離心。

（4）標(biāo)準(zhǔn)品1：加10μl標(biāo)準(zhǔn)品母液到第1管，蓋蓋并混勻。簡要離心。

（5）標(biāo)準(zhǔn)品2：從第1管中取出10μl到第2管，蓋蓋并混勻。簡要離心。

（6）標(biāo)準(zhǔn)品3：從第2管中取出10μl到第3管，蓋蓋并混勻。簡要離心。

（7）下面的管均重復(fù)以上步驟。推薦制備6個標(biāo)準(zhǔn)品（梯度稀釋）。

3、PCR擴增

溶解的DNA可直接用于常規(guī)PCR。德國MB公司推薦Venor?GeM PCR試劑盒用于支原體檢測，或Onar?

Bacteria PCR試劑盒用于細胞培養(yǎng)中的細菌檢測。

對于qPCR，使用梯度稀釋的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，可制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。大多數(shù)qPCR軟件允許通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量分析。這依賴于正確的設(shè)置，包括標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)。為便于正確定量，要確定你的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。使用者可以試用下列參數(shù)用于設(shè)置。體積決定了每個PCR反應(yīng)的基因組拷貝數(shù)。


反應(yīng)管編號

2μl樣品

5μl樣品

10μl樣品

1

2×105基因組拷貝

5×105基因組拷貝

1×106基因組拷貝

2

2×104基因組拷貝

5×104基因組拷貝

1×105基因組拷貝

3

2×103基因組拷貝

5×103基因組拷貝

1×104基因組拷貝

4

200基因組拷貝

500基因組拷貝

1000基因組拷貝

5

20基因組拷貝

50基因組拷貝

100基因組拷貝

6

2基因組拷貝

5基因組拷貝

10基因組拷貝


4、評估

使用梯度稀釋，qPCR檢測后Ct值會隨著DNA濃度下降而升高。通過Ct值和DNA樣本量產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知樣本的濃度通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計算。下列的擴增曲線是用德國MB公司的Venor?

GeM qEP試劑盒繪制的。所用儀器為CFX96 Touch熒光定量PCR儀。

圖1. 梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的擴增曲線。標(biāo)準(zhǔn)品為發(fā)酵支原體的106至10個基因組拷貝數(shù)。

圖2.用Bio-Rad CFX Manager軟件產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總之，PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品可提供低拷貝數(shù)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，因而可精準(zhǔn)確定核酸法的檢測限。而10CFU的靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品只能觀察是否能達到這一閾值，而無法確定最終為多少。從這個角度說，PCR絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品具有自己獨特的優(yōu)勢。