細胞狀態不好，你排除過支原體嗎？（上）

1、支原體的分離培養

  它是支原體污染鑒定的金標準，準確，價格便宜。但支原體在分離培養的過程中，要長出明顯克隆至少需要4周時間，所需時間較長。

2、ELISA方法

  檢測步驟復雜，出現誤差的幾率較高，對實驗者操作技巧有要求。同時試劑盒成本較高，普遍不被選用。

3、DNA熒光染色法

  它采用熒光染色劑Hoechst 33258和支原體DNA富含A-T的區域結合。價格適中。由于DNA檢測需要將可疑樣品與指示細胞共同培養，因此一般需要幾天后才出結果。有假陽性和假陰性，需要與其他方法結合使用。

4、PCR技術

它根據支原體核糖體16s-23s rRNA的特異保守序列設計引物，對待檢樣本DNA進行擴增，通過對擴增產物的大小分析作出診斷（見下圖）。操作簡單、速度快，只需2-3小時即可出結果，通量高，價格適中。但是，不同廠家生產的PCR檢測試劑盒由于引物及內在設計的不同，其準確度和敏感度有天壤之別。

目前，被全球各大實驗室及生物藥廠普遍選用的是德國Minerva Biolabs公司開發生產的支原體PCR檢測試劑盒。試劑盒在267bp的條帶，涵蓋了歐洲《藥典》中最易感染細胞的26種支原體亞型，保證了其超強的敏感度；通過內控條帶的設計，防止了假陰性的發生。我國農業部在2008年豬藍耳病疫苗研制的重點項目中，實驗者用此檢測法與培養法做了超過100次的平行比對實驗，結果全部一致，假陽性率和假陰性率為零。

因此，用PCR方法檢測支原體，其準確性與選擇的試劑盒的質量有直接相關性。

圖：有支原體污染的樣本在267bp位置有陽性條帶。Internal Control為內部對照，在190bp，保證PCR反應的正常。