用于轉染和單細胞培養的化學限定培養基

2015年第24屆歐洲動物細胞技術學會年會

題目：用于轉染和單細胞培養的化學限定培養基

BMC Proceedings20159 (Suppl 9) :P27

https://doi.org/10.1186/1753-6561-9-S9-P27

背景

先進的培養基和補料開發已經多次證明了其提高生物工藝效率的潛力。通過應用這種先進的化學限定和無動物成分配方，結合最新的細胞系，哺乳動物細胞培養物的產量被推進到每升2克。本文介紹了用于轉染和單細胞生長的專用培養基的設計進展。瞬時轉染在基礎科研、藥物原料生產、個體醫學和疫苗生產上都有應用。瞬時基因有效表達的規模升級，需要同時支持細胞生長和轉染的雙功能培養基。

材料與方法

在96孔板中觀察了化學限定的無動物源培養基對單細胞生長的影響，并與含血清培養基進行了比較。單細胞的生長通過Cellavista高通量細胞成像和分析工作站進行分析，并對不同的CHO細胞系進行了克隆選擇和規模升級（擴大到轉瓶培養）。亞克隆細胞表達的重組蛋白分離后用ELISA定量，并進行了活性測定。

對瞬時轉染，開發的培養基配方在CHO細胞和人細胞系上進行了測試。轉染效率用陽離子多聚體轉染試劑盒和GFP表達質粒進行評估。對轉染后采用分批培養、流加培養和偽灌注培養的HEK細胞系表達IgG1抗體進行了調查，蛋白A聯合HPLC進行抗體定量。被陽離子試劑轉染的細胞密度通常為3×106細胞/ml，表達GFP或IgG1的質粒為2pgDNA/細胞。轉染期間細胞培養體積為4ml~1000ml。

結果

結果顯示，不同的單細胞能成功的從96孔板擴增至24孔板，再到細胞培養瓶和轉瓶。采用有限稀釋法得到的細胞存在個體差異，所篩選的細胞克隆表現出不同的生長和表達性能。8個有代表性的細胞克隆最高密度為1.9×106/ml至8.5×106次方/ml，表達的蛋白產量和活性存在3倍的差異。無動物源細胞培養基對應的克隆效率仍高于含血清的培養基。

對于瞬時轉染，研發的HEK轉染培養基支持穩定的細胞生長，使分批培養的細胞保持高密度（最高為16X106 細胞/ml）和高存活率，在轉染時使用新鮮培養基，對于不同的HEK細胞系，轉染效率為68%-94%。對于一種待評估的CHO細胞系，效率達75%-92%（見圖1A）。成功的小規模偽灌注培養顯示該方法的可行性，并且可應用于生物反應器。對于不穩定的產物如特異性的酶，該灌流過程令人關注。瞬時轉染用的一款商品化培養基培養的細胞表達的單克隆抗體滴度為90-150mg/L，而用研發的Xell培養基，可使單抗滴度升高至310-430mg/L,平均升高了3.1倍。在轉染后使用優化的流程和合適的培養基，可使產量進一步升高至750 - 850 mg/L。和對照的培養基相比，升高了6.7倍（見圖1B）。

圖1. 轉染效率總覽。A. 使用開發的Xell培養基。盡管該培養基專為HEK細胞設計，但對另一種人細胞系和CHO-K1也支持高效轉染。B. 轉染基因表達的單克隆抗體量。Xell開發的培養基和一款商品化培養基進行了比較。