qPCR Kit   (經(jīng)典法)

Venor?Gem qEP

支原體qPCR法介紹：

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，將『針對(duì)支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記，使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號(hào)的變化和配套軟件，進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，簡(jiǎn)稱(chēng)qPCR。

優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高、特異性強(qiáng)。

          ②時(shí)間短，2-3小時(shí)出結(jié)果。

          ③檢測(cè)結(jié)果可定量。

          ④操作簡(jiǎn)便。

缺點(diǎn)：①對(duì)于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。（可用培養(yǎng)法做補(bǔ)充驗(yàn)證）

          ②不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計(jì)不同），需謹(jǐn)慎選擇，盡量在專(zhuān)業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。

『支原體qPCR檢測(cè)試劑盒』介紹

德國(guó)MB公司生產(chǎn)的支原體qPCR檢測(cè)試劑盒（均為探針?lè)z測(cè)），依據(jù)操作步驟的細(xì)微差別，

分『經(jīng)典法』和『一步法』兩種。   

此兩類(lèi)試劑盒較全球其他廠(chǎng)家同類(lèi)產(chǎn)品，具有以下獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：

①經(jīng)典法qPCR試劑盒遵循歐洲藥典流程要求

②高特異性，一次檢測(cè)即可涵蓋了所有可能感染細(xì)胞的支原體物種（涵蓋歐洲藥典規(guī)定的9種支原體），根據(jù)序列一致性，至少可以檢測(cè)到107種支原體物種。操作簡(jiǎn)單，易于觀察。

（使用MB的試劑盒，下表中列出的支原體物種均為陽(yáng)性，其他微生物或真核細(xì)胞均為陰性，無(wú)交叉反應(yīng)）

③高靈敏度，MB公司的經(jīng)典法試劑盒最低檢測(cè)限可達(dá)到≤10CFU/ml。

MB公司的一步法qPCR試劑盒最低檢測(cè)限≥50個(gè)基因組/反應(yīng)。

④MB公司有相應(yīng)配套的10CFU/100CFU的敏感度測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)品，便于方法學(xué)驗(yàn)證。

⑤MB公司有相應(yīng)配套的支原體基因組DNA和細(xì)菌基因組DNA，便于特異性驗(yàn)證。

⑥MB公司有相應(yīng)配套的支原體絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品，便于最后定量檢測(cè)。

特點(diǎn)

1. 內(nèi)控對(duì)照為獨(dú)立包裝，遵循歐洲藥典和日本藥典操作流程。

2. 高特異性，一次檢測(cè)即可涵蓋所有常見(jiàn)易感染細(xì)胞的支原體物種（包括歐洲藥典規(guī)定的9種支原體）。與細(xì)菌和真核DNA無(wú)交叉反應(yīng)。

3. 高靈敏度，最低檢測(cè)限可達(dá)到≤10CFU/ml。

4. 有相應(yīng)配套的支原體基因組DNA和細(xì)菌基因組DNA，便于特異性驗(yàn)證。

5.有相應(yīng)配套的支原體絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品，便于最后定量檢測(cè)。

操作步驟

第1步：樣本處理

a.細(xì)胞培養(yǎng)上清

b. 生物藥或需遵循藥典的樣本

說(shuō)明：①樣品基質(zhì)可能會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度。收集和篩選更高的樣品量可提高測(cè)定靈敏度。

          ②細(xì)胞培養(yǎng)物樣本含豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原DNA，影響檢測(cè)靈敏度。

          建議：樣本做DNA抽提處理，實(shí)現(xiàn)最高靈敏度。

          推薦：德國(guó)MB公司生產(chǎn)的專(zhuān)用支原體DNA提取試劑盒

          Venor? Gem Sample Preparation Kit

          該DNA抽提試劑盒已經(jīng)過(guò)廣泛驗(yàn)證。

第2步：試劑制備

a. 凍干粉溶解

b. 反應(yīng)體系制備

b1) 樣品為細(xì)胞上清篩查——反應(yīng)體系制備

b2) 樣品為生物藥——反應(yīng)體系制備

第3步：?jiǎn)?dòng)熒光定量PCR儀

第4步：結(jié)果判別

FAM通道：檢測(cè)支原體熒光信號(hào)。HEX通道：檢測(cè)內(nèi)控對(duì)照熒光信號(hào)。

支原體DNA和內(nèi)控DNA存在信號(hào)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

支原體DNA越多，F(xiàn)AM通道信號(hào)越高，檢測(cè)內(nèi)控對(duì)照的HEX通道信號(hào)越低。

定量需基于Ct值和DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

Ct＜40為陽(yáng)性結(jié)果。Ct≥40為陰性結(jié)果。

示意圖：

儲(chǔ)存條件

2~8℃保存至少12個(gè)月。復(fù)溶后-18℃以下保存。

效期

1年6個(gè)月