GyrI-like 蛋白通過其環丙基水解活性實現細胞保護功能

微生物對抗生素的抗性是一種古老的自然現象，它的出現遠遠早于人類對抗生素的使用。臨床上使用的抗生素有相當一部分是由微生物發酵產生的，這些微生物需要進化出對應的抗性基因來保護自己免受所產生抗生素的傷害（自抗性）。這些抗性基因在不同微生物間的水平轉移導致多藥耐藥菌、甚至泛耐藥菌變得越來越普遍。因此，對抗生素的生物合成與自抗性機制的研究將有助于人們對抗性基因的產生、進化以及轉移得到深入的認識和理解。

中國科學院上海有機化學研究所生命有機化學國家重點實驗室的唐功利課題組多年來一直致力于對結構獨特、活性顯著的復雜天然產物進行生物合成和自抗性機制研究，從酶催化反應的角度理解自然界神奇的化學反應和生理性拮抗的生化 / 化學本質，屬于典型的有機化學 - 微生物學 - 生物化學 - 天然產物藥學的交叉學科，對于天然產物藥物研究中重點關注新結構的發現、創造和復雜化合物的高效制備均具有重要的推動作用。

以谷田霉素（YTM）和 CC-1065 為代表的苯并二吡咯生物堿家族抗腫瘤抗生素的生物合成和自抗性機制研究則集中體現了上述思想。該家族的天然產物是一類來源于微生物、含有環丙烷藥效團的高活性天然產物，目前包括 YTM、CC-1065 和多卡霉素。這些化合物主要是對細胞內的遺傳物質 DNA 進行烷基化修飾，從而達到殺死細胞的目的（IC50 為 pM 級）。研究表明這類化合物是靶向治療中理想的“彈頭”，例如，由多卡霉素衍生的抗體藥物偶聯分子 MDX-1203 已進入臨床一期，主要治療非霍奇金淋巴瘤和腎細胞癌。唐功利課題組前期克隆了 YTM（J. Am. Chem. Soc., 2012, 134, 8831）和 CC-1065（ACS Chem. Biol., 2017, 12, 1603）的生物合成基因簇，并發現 DNA 糖苷酶 YtkR2 可以將由 YTM 烷基化引起的損傷堿基移除，從而開啟 DNA 的一系列修復機制（Angew. Chem. Int. Ed.,2012, 51, 10532）。

最近，唐功利研究團隊在該家族天然產物的自抗性機制研究方面再獲新突破。該團隊從 YTM 研究材料出發，證明了 YtkR7（屬于 GyrI-like 家族蛋白）可以水解 YTM 的環丙基，從而起到 YTM 失活的目的。接下來他們揭示了 GyrI-like 家族的一個亞家族蛋白（截至 2016 年 9 月已有 1696 條蛋白序列都來源于原核生物）具有水解 YTM 和 CC-1065 環丙基的特性，這也是 GyrI-like 家族蛋白成員**證明具有酶的活性（作者將這類酶定義為 cyclopropanoid cyclopropyl hydrolase, CCH）。

圖 1. CCH 蛋白催化環丙烷化合物的環丙基水解反應

為了深入闡明 CCH 是如何識別并催化底物中環丙基水解反應的機理，唐功利課題組與上海有機化學研究所生命有機化學國家重點實驗室的周佳海課題組以及瑞士洛桑聯邦理工學院 EPFL 的袁曙光課題組在晶體學和計算生物學方面展開合作，通過共晶結構以及分子動力學模擬發現，CCH 蛋白都具有一個保守的用于多種底物結合的芳香口袋（由 Y46、W85、W99、F154 和 Y187 組成）以及兩個高度保守的負責催化的酸性氨基酸殘基對（E185/E157）。作者通過點突變實驗證實了這個芳香口袋和催化殘基在 YTM 和 CC-1065 環丙基水解反應中起著關鍵作用，隨后提出了可能的催化機理。

圖 2. 通過共晶復合物以及分子動力學模擬研究 CCH 蛋白成員 lin2189 與底物 YTM 的識別

接下來，作者從 CCH 蛋白中選取四個代表成員 YtkR7、lin2189（來源于 Listeria innocua）、ETI84332.1（來源于 Streptococcus anginosus，屬于腸道微生物）以及 MA1133（來源于 Methanosarcina acetivorans），并將其分別轉化大腸桿菌，發現這些蛋白都能夠賦予大腸桿菌對 YTM 的抗性。

GyrI-like 蛋白廣泛存在于原核與真核生物中（截至 2016 年 9 月已有 12304 條蛋白序列），這類蛋白被注釋為小分子結合蛋白。但是這種小分子結合屬性**于對枯草芽孢桿菌 MerR 家族調控蛋白 BmrR 的研究。BmrR 可以對多種結構不同的配體化合物進行響應，而結合了配體的 BmrR 能夠激活多藥抗性外排泵蛋白 Bmr 基因的轉錄，從而起到細胞的自我保護作用。SbmC 和 Rob 是 GyrI-like 家族蛋白中另外兩個已報道的具有生理功能的成員。但是，SbmC 和 Rob 是否能結合小分子尚無文獻報道。因此，在文章最后，作者通過分子互作分析（SPR）證明了 SbmC、Rob 以及 YtkR7 均保留了結合若干抗生素的能力。

CCH 蛋白功能的發現使人們重新審視 GyrI-like 蛋白功能，即生物體利用 GyrI-like 蛋白作為抗生素抗性蛋白可能是一種古老的現象，這類蛋白可以看作是細胞內的清道夫，通過隔離外源性有毒化合物達到保護細胞的目的。因此，這項工作不僅為真核生物中 GyrI-like 蛋白的功能研究提供了重要的借鑒，也為藥物研發領域提供了一定的參考意義。

這一成果發表在最近的 Nature Communications 上，唐功利課題組的袁華副研究員和周佳海課題組的張金儒博士為共同**作者。該工作得到國家自然科學基金委、上海市科委和中國科學院戰略性先導科技專項（B 類）等經費的大力資助。