常見細胞培養問題解答

常見細胞培養問題解答

1. 如果收到一管凍存的細胞，能直接把它放到液氮中保存嗎？

在很多情況下，干冰（-80°C）運輸的細胞可以放回液氮，之后再進行快速解凍。然而，這樣處理后可能降低細胞活力。對于一些敏感的細胞系，這可能使細胞復蘇更加困難。這種現象被認為是由于溫度變化導致的細胞內冰晶結構的改變。因此，建議細胞在收到后應盡快解凍和培養。**減少在-80°C的儲存時間，**這種溫度只用于運輸。

2. 從液氮中取出細胞復蘇時，應采取哪些安全措施？

在液氮中的細胞凍存管如果沒有完全密封，有液氮漏入，解凍時凍存管的氣溫急劇上升，可能會導致爆炸。因此，當從液氮中取出細胞時，建議佩戴護目鏡和防護手套。復蘇時，應將凍存管在37°C水浴中不斷搖動，在1-2分鐘內使凍存液完全融化。之后用酒精棉球擦拭凍存管外壁，再拿入超凈臺內，將細胞轉移到已加入10ml培養液的離心管內，1000 rpm下離心5～10分鐘，棄去上清液，加入適量培養液后接種于培養瓶中，置 5% CO₂孵箱靜置培養。

3、為什么應將細胞儲存在液氮罐中的氣相而非液相？

細胞儲存在液氮氣相中更容易復蘇。而在液氮的液相中，如果凍存管沒有正確密封或有泄漏，細胞與液氮直接接觸，會使細胞解凍后活力受到影響。

4、對于懸浮細胞，如何更換培養基？

培養懸浮細胞可以只是簡單地添加新鮮培養基（如果空間允許）或者通過離心（100×g 5分鐘）從舊培養基中分離細胞，隨后將沉淀的細胞再懸浮于新鮮培養基中。然而，對于大多數懸浮細胞系，簡單添加培養基是更好的方法。無論哪種方法，都需要細胞達到其**飽和密度之前更新培養基。細胞的飽和密度在3×10 ⁵至2×10 ⁶之間，具體依賴于細胞系和培養條件（靜置或攪動、氧合水平等）。細胞必須稀釋至較低的細胞濃度以允許足夠的營養物質恢復，使細胞保持對數生長。假如只是簡單地更換培養基而不降低細胞密度，細胞就會迅速耗竭培養基并死亡。如果細胞被稀釋到其最小密度之下，則會進入滯后期，生長非常緩慢，或者會死亡。每種懸浮細胞系的飽和密度和傳代間隔都不一樣，因此，每日細胞計數是監測懸浮細胞系的**方式。

5. 細胞培養推薦的CO₂水平是多少？

盡管細胞培養體系中的CO₂水平范圍為0.03％~40%（通常大氣中的CO₂約0.03％），但最常見的在空氣中不添加CO₂或者CO₂濃度為5％~10％。調節培養基中碳酸氫鈉的濃度以與氣相中CO₂水平達到平衡非常重要。細胞會產生CO₂，需要少量的碳酸用于生長和存活。如果不添加CO₂并且細胞大量繁殖，則可以使用4mM（0.34g / L）的無水碳酸氫鈉。然而，這時培養瓶蓋子應擰緊。如果培養體系需要5％或10％的CO₂，則在37℃下分別使用23.5mM（1.97g / L）或47mM（3.95g / L）碳酸氫鈉，初始pH為約7.6。在這些條件下，應使培養瓶松蓋或使用培養皿來保持氣體平衡。

6. 為什么一些細胞需要丙酮酸鈉？我應加多少丙酮酸鈉到培養基中？

丙酮酸鹽是糖酵解途徑中的**個容易進出細胞的有機酸代謝物。 因此，培養基中添加丙酮酸鈉能同時為合成代謝提供能量源和碳源，有助于維持某些特定的細胞，有助于細胞克隆或者在培養基中血清濃度降低時需要。丙酮酸鈉還有助于降低熒光引發的細胞毒性。通常加入的丙酮酸鈉終濃度為1mM。商品化的丙酮酸鈉溶液通常為100mM儲存液（100X）。

   7.  培養瓶、培養板和培養皿中的細胞密度是多少？

請參考如下數據：

細胞產量根據細胞密度1 x 10⁶ cells/ cm²進行的估算。

細胞產量根據細胞密度1 x 10⁵ cells/ cm²進行的估算。

多孔板中細胞的接種密度：

成像時**密度通常為7500-20000個細胞/孔（96孔板）和1000-4000個細胞/孔（384孔板）。  細胞密度過高會導致自動對焦困難，特別是如果細胞長滿，并且擠在一起，通常會導致一些細胞位于焦點之外。細胞密度過低，導致許多空白區域和焦點損失，特別是在使用較高放大倍數時。接種密度可以通過在培養板上接種不同稀釋濃度的細胞，并使其在實驗條件下生長（可以促進或阻止生長）來評估。