肌萎縮側(cè)索硬化癥新探索:構(gòu)建新的隱剪接 選擇性糾正TDP-43缺陷引起的ALS相關(guān)隱外顯子剪接錯誤

精準(zhǔn)醫(yī)療設(shè)想在正確的時間將正確的藥物提供給正確的細(xì)胞。這種方法徹底改變了癌癥治療，根據(jù)特定的突變或其他分子特征來設(shè)計針對腫瘤的藥物。鑒于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)方法在腫瘤學(xué)領(lǐng)域的成功，將類似的策略應(yīng)用于腦部疾病——只對需要治療的腦細(xì)胞提供治療而不影響健康的腦細(xì)胞——將是革命性的。

肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)是一種致命的神經(jīng)退行性疾病，由大腦和脊髓的運動神經(jīng)元選擇性喪失引起。這種疾病有許多不同的潛在遺傳和環(huán)境因素，但幾乎所有ALS患者的神經(jīng)系統(tǒng)都有一個共同的分子特征——小部分神經(jīng)元亞群細(xì)胞核中一種叫做TDP-43（TAR DNA-binding Protein)的RNA結(jié)合蛋白的功能喪失。TDP-43缺失導(dǎo)致一種與隱外顯子剪接出錯有關(guān)的RNA加工事件。這一分子事件改變了數(shù)千個RNA的正常處理過程，導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙。我們都知道正常細(xì)胞中成熟的mRNA中通常不包括內(nèi)含子中的DNA序列，TDP-43結(jié)合在這些隱外顯子附近，并確保它們被剪接出來。當(dāng)TDP-43從細(xì)胞核中丟失時，這種抑制就會丟失，成熟的mRNA中就保留了隱外顯子（ cryptic exons）。那些對神經(jīng)元功能至關(guān)重要的基因或攜帶疾病風(fēng)險變異的基因轉(zhuǎn)錄子中若保留多余的隱外顯子，會引起閱讀框移碼、降低RNA穩(wěn)定性、或產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)同種異構(gòu)體。TDP-43功能喪失 (TDP-LOF)也是多種其他神經(jīng)退行性疾病的標(biāo)志。

但在ALS患者中并不是所有的神經(jīng)元都有TDP-43缺陷，所以挑戰(zhàn)之一是只靶向那些具有TDP-43病理的神經(jīng)元，而不是那些具有正常TDP-43功能的神經(jīng)元，避免進一步惡化病情。

來自英國倫敦大學(xué)學(xué)院的研究人員在新一期《Science》上描述了一種治療運動神經(jīng)元疾病——肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)的精確醫(yī)學(xué)策略：遞送合成的“隱式”外顯子，僅在顯示ALS特征的細(xì)胞中驅(qū)動基因表達，這些發(fā)現(xiàn)為ALS的研究開辟了新的方向——將隱剪接事件（cryptic splicing events）作為潛在生物標(biāo)志物及治療靶點，也為神經(jīng)退行性疾病的精準(zhǔn)醫(yī)療策略打下基礎(chǔ)。

如何找出一種方法來區(qū)分TDP-43功能喪失的細(xì)胞和TDP-43功能正常的細(xì)胞？作者聰明地意識到，他們可以利用TDP-43功能喪失的關(guān)鍵——隱外顯子作為一種傳感器，來檢測TDP-43何時何地功能失調(diào)，然后只對這些缺陷細(xì)胞進行治療。作者首先設(shè)計一種僅當(dāng)TDP-43功能失調(diào)時能在細(xì)胞中開啟紅色熒光蛋白表達的結(jié)構(gòu)——構(gòu)建了一個包含編碼紅色熒光蛋白序列的嵌合基因，在具有正常TDP-43功能的細(xì)胞中隱外顯子被移除會阻止熒光蛋白質(zhì)產(chǎn)生；但在沒有TDP-43的細(xì)胞中隱外顯子保留了下來，使熒光蛋白得以產(chǎn)生。他們將這種嵌合基因引入經(jīng)過改造的人類細(xì)胞系中，通過藥物來關(guān)閉TDP-43時細(xì)胞發(fā)出紅光。作者將該系統(tǒng)命名為TDP-REG，因為它允許他們利用TDP-43作為基因表達調(diào)節(jié)器的功能，可根據(jù)剪接變化，實現(xiàn)疾病特異性基因治療表達的空間和時間調(diào)控。

驗證了TDP-REG工具，作者嘗試用它來糾正與ALS相關(guān)的單個隱剪接事件。他們用一種經(jīng)過修飾的Cas9酶代替了熒光蛋白，這種Cas9酶允許進行靶向基因組編輯。

他們首先對編碼UNC-13同源蛋白的UNC13A基因進行“搜索和替換”編輯，阻斷了TDP- 43缺陷神經(jīng)元中UNC13A基因的隱外顯子，使之在沒有TDP- 43的情況下成熟UNC13A mRNA也不包含隱外顯子，維持缺陷神經(jīng)元中UNC13A蛋白的正常水平。這是v1版。

然后，作者對TDP-REG進行了v2版修改：不僅一次修復(fù)一個TDP-43調(diào)節(jié)的隱外顯子，而且能同時糾正多個隱外顯子。他們通過使用TDP-43和核糖核蛋白PTB結(jié)合1 (RAVER1)蛋白的剪接抑制域之間的融合蛋白實現(xiàn)了這一目標(biāo)。

肌萎縮側(cè)索硬化癥是一種具有毀滅性的侵襲性和快速發(fā)展的疾病，一旦做出診斷，治療可能為時已晚，無法發(fā)揮作用。這種巧妙的治療策略，可以在需要治療的神經(jīng)元而不是不需要治療的神經(jīng)元中糾正ALS的病理。由于TDP-REG內(nèi)置的安全功能，作者認(rèn)為可以在有患病風(fēng)險的患者(可能是因為遺傳易感性因素，TDP-43功能障礙被激活之前)在癥狀前階段接受這些治療。TDP-REG的模塊化設(shè)計策略也可能支持未來的修改，以針對新的疾病相關(guān)病理、細(xì)胞類型和細(xì)胞狀態(tài)。這項工作使我們離神經(jīng)退行性疾病(如ALS)的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)治療又近了一步。

鑒于TDP-LOF功能缺失是ALS、FTD和其他常見神經(jīng)退行性疾病(包括阿爾茨海默病和LATE)的標(biāo)志，TDP-REG可能在這些疾病的治療中具有廣泛的用途。在單細(xì)胞分辨率下，疾病誘導(dǎo)的基因療法激活可能有助于減輕患者**轉(zhuǎn)基因表達的潛在風(fēng)險。此外，在攜帶ALS因果遺傳變異的高危個體中，TDP-REG的空間和時間特異性可以使治療藥物在癥狀前階段進行，直到檢測到TDP-43病理的**階段。此外，TDP-REG可用于藥物開發(fā)的臨床前階段，作為細(xì)胞甚至活體動物中TDP-43病理的實時讀數(shù)。

TDP-REGv1涉及轉(zhuǎn)基因與上游調(diào)控模塊的融合，具有源自現(xiàn)有人類基因的修飾隱外顯子序列。這種方法有幾個好處：作為模塊化設(shè)計，不同的轉(zhuǎn)基因可以由相同的上游調(diào)控模塊控制。此外，TDP-REGv1是基于經(jīng)過充分驗證的、以疾病特異性方式在患者中檢測到的內(nèi)源性隱外顯子。

相比之下，TDP-REGv2使用嵌入轉(zhuǎn)基因序列本身的合成剪接傳感器。這解決了TDP-REGv1和以前方法的幾個局限性:它不需要長時間的上游調(diào)控區(qū)域，從而有助于將大型轉(zhuǎn)基因包裝成AAV載體；它阻止上游不需要的肽被表達并釋放到細(xì)胞中，而且它是高度可調(diào)的，這意味著剪接特性可以針對所傳遞的特定轉(zhuǎn)基因進行優(yōu)化。

拼接規(guī)律是一個非常復(fù)雜的問題，難以用傳統(tǒng)的算法進行預(yù)測。在TDP-REGv2的開發(fā)過程中，作者創(chuàng)建了一個名為SpliceNouveau的算法，該算法利用深度學(xué)習(xí)拼接預(yù)測和合理設(shè)計原則來優(yōu)化向量，幫助確保它們以所需的方式拼接。使用SpliceNouveau成功設(shè)計了當(dāng)TDP-43存在時優(yōu)先使用的競爭性替代剪接位點，成功地生成了隱式盒外顯子和隱式替代剪接位點。SpliceNouveau設(shè)計的載體的靈活性和高成功率代表了剪接調(diào)節(jié)載體技術(shù)的重大進步。

這項研究證明了如何反向利用驅(qū)動ALS和FTD進展的隱剪接，以實現(xiàn)靶向異常細(xì)胞的治療性蛋白表達。這種方法與先前已被批準(zhǔn)用于基因治療的傳統(tǒng)AAV兼容，可以很容易地適用于不同的轉(zhuǎn)基因，包括調(diào)整其**表達和對TDP-43缺失的敏感性。這將**限度地減少毒副作用的風(fēng)險，從而提高在臨床試驗期間獲得可衡量改善的機會，減少患者的危險。

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