肌萎縮側索硬化癥新探索:構建新的隱剪接 選擇性糾正TDP-43缺陷引起的ALS相關隱外顯子剪接錯誤

精準醫療設想在正確的時間將正確的藥物提供給正確的細胞。這種方法徹底改變了癌癥治療，根據特定的突變或其他分子特征來設計針對腫瘤的藥物。鑒于精準醫學方法在腫瘤學領域的成功，將類似的策略應用于腦部疾病——只對需要治療的腦細胞提供治療而不影響健康的腦細胞——將是革命性的。

肌萎縮側索硬化癥(ALS)是一種致命的神經退行性疾病，由大腦和脊髓的運動神經元選擇性喪失引起。這種疾病有許多不同的潛在遺傳和環境因素，但幾乎所有ALS患者的神經系統都有一個共同的分子特征——小部分神經元亞群細胞核中一種叫做TDP-43（TAR DNA-binding Protein)的RNA結合蛋白的功能喪失。TDP-43缺失導致一種與隱外顯子剪接出錯有關的RNA加工事件。這一分子事件改變了數千個RNA的正常處理過程，導致神經元功能障礙。我們都知道正常細胞中成熟的mRNA中通常不包括內含子中的DNA序列，TDP-43結合在這些隱外顯子附近，并確保它們被剪接出來。當TDP-43從細胞核中丟失時，這種抑制就會丟失，成熟的mRNA中就保留了隱外顯子（ cryptic exons）。那些對神經元功能至關重要的基因或攜帶疾病風險變異的基因轉錄子中若保留多余的隱外顯子，會引起閱讀框移碼、降低RNA穩定性、或產生新的蛋白質同種異構體。TDP-43功能喪失 (TDP-LOF)也是多種其他神經退行性疾病的標志。

但在ALS患者中并不是所有的神經元都有TDP-43缺陷，所以挑戰之一是只靶向那些具有TDP-43病理的神經元，而不是那些具有正常TDP-43功能的神經元，避免進一步惡化病情。

來自英國倫敦大學學院的研究人員在新一期《Science》上描述了一種治療運動神經元疾病——肌萎縮側索硬化癥(ALS)的精確醫學策略：遞送合成的“隱式”外顯子，僅在顯示ALS特征的細胞中驅動基因表達，這些發現為ALS的研究開辟了新的方向——將隱剪接事件（cryptic splicing events）作為潛在生物標志物及治療靶點，也為神經退行性疾病的精準醫療策略打下基礎。

如何找出一種方法來區分TDP-43功能喪失的細胞和TDP-43功能正常的細胞？作者聰明地意識到，他們可以利用TDP-43功能喪失的關鍵——隱外顯子作為一種傳感器，來檢測TDP-43何時何地功能失調，然后只對這些缺陷細胞進行治療。作者首先設計一種僅當TDP-43功能失調時能在細胞中開啟紅色熒光蛋白表達的結構——構建了一個包含編碼紅色熒光蛋白序列的嵌合基因，在具有正常TDP-43功能的細胞中隱外顯子被移除會阻止熒光蛋白質產生；但在沒有TDP-43的細胞中隱外顯子保留了下來，使熒光蛋白得以產生。他們將這種嵌合基因引入經過改造的人類細胞系中，通過藥物來關閉TDP-43時細胞發出紅光。作者將該系統命名為TDP-REG，因為它允許他們利用TDP-43作為基因表達調節器的功能，可根據剪接變化，實現疾病特異性基因治療表達的空間和時間調控。

驗證了TDP-REG工具，作者嘗試用它來糾正與ALS相關的單個隱剪接事件。他們用一種經過修飾的Cas9酶代替了熒光蛋白，這種Cas9酶允許進行靶向基因組編輯。

他們首先對編碼UNC-13同源蛋白的UNC13A基因進行“搜索和替換”編輯，阻斷了TDP- 43缺陷神經元中UNC13A基因的隱外顯子，使之在沒有TDP- 43的情況下成熟UNC13A mRNA也不包含隱外顯子，維持缺陷神經元中UNC13A蛋白的正常水平。這是v1版。

然后，作者對TDP-REG進行了v2版修改：不僅一次修復一個TDP-43調節的隱外顯子，而且能同時糾正多個隱外顯子。他們通過使用TDP-43和核糖核蛋白PTB結合1 (RAVER1)蛋白的剪接抑制域之間的融合蛋白實現了這一目標。

肌萎縮側索硬化癥是一種具有毀滅性的侵襲性和快速發展的疾病，一旦做出診斷，治療可能為時已晚，無法發揮作用。這種巧妙的治療策略，可以在需要治療的神經元而不是不需要治療的神經元中糾正ALS的病理。由于TDP-REG內置的安全功能，作者認為可以在有患病風險的患者(可能是因為遺傳易感性因素，TDP-43功能障礙被激活之前)在癥狀前階段接受這些治療。TDP-REG的模塊化設計策略也可能支持未來的修改，以針對新的疾病相關病理、細胞類型和細胞狀態。這項工作使我們離神經退行性疾病(如ALS)的精準醫學治療又近了一步。

鑒于TDP-LOF功能缺失是ALS、FTD和其他常見神經退行性疾病(包括阿爾茨海默病和LATE)的標志，TDP-REG可能在這些疾病的治療中具有廣泛的用途。在單細胞分辨率下，疾病誘導的基因療法激活可能有助于減輕患者**轉基因表達的潛在風險。此外，在攜帶ALS因果遺傳變異的高危個體中，TDP-REG的空間和時間特異性可以使治療藥物在癥狀前階段進行，直到檢測到TDP-43病理的**階段。此外，TDP-REG可用于藥物開發的臨床前階段，作為細胞甚至活體動物中TDP-43病理的實時讀數。

TDP-REGv1涉及轉基因與上游調控模塊的融合，具有源自現有人類基因的修飾隱外顯子序列。這種方法有幾個好處：作為模塊化設計，不同的轉基因可以由相同的上游調控模塊控制。此外，TDP-REGv1是基于經過充分驗證的、以疾病特異性方式在患者中檢測到的內源性隱外顯子。

相比之下，TDP-REGv2使用嵌入轉基因序列本身的合成剪接傳感器。這解決了TDP-REGv1和以前方法的幾個局限性:它不需要長時間的上游調控區域，從而有助于將大型轉基因包裝成AAV載體；它阻止上游不需要的肽被表達并釋放到細胞中，而且它是高度可調的，這意味著剪接特性可以針對所傳遞的特定轉基因進行優化。

拼接規律是一個非常復雜的問題，難以用傳統的算法進行預測。在TDP-REGv2的開發過程中，作者創建了一個名為SpliceNouveau的算法，該算法利用深度學習拼接預測和合理設計原則來優化向量，幫助確保它們以所需的方式拼接。使用SpliceNouveau成功設計了當TDP-43存在時優先使用的競爭性替代剪接位點，成功地生成了隱式盒外顯子和隱式替代剪接位點。SpliceNouveau設計的載體的靈活性和高成功率代表了剪接調節載體技術的重大進步。

這項研究證明了如何反向利用驅動ALS和FTD進展的隱剪接，以實現靶向異常細胞的治療性蛋白表達。這種方法與先前已被批準用于基因治療的傳統AAV兼容，可以很容易地適用于不同的轉基因，包括調整其**表達和對TDP-43缺失的敏感性。這將**限度地減少毒副作用的風險，從而提高在臨床試驗期間獲得可衡量改善的機會，減少患者的危險。

本網站所有轉載文章系出于傳遞更多信息之目的，轉載內容不代表本站立場。不希望被轉載的媒體或個人可與我們聯系，我們將立即進行刪除處理。