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支原體污染pcr檢測步驟

2024-08-22 16:41

支原體污染PCR檢測步驟主要包括樣品收集與處理、DNA提取、PCR反應體系配置、PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳以及結果分析等幾個關鍵步驟。以下是詳細的步驟說明:

一、樣品收集與處理

樣品收集:

收集待測細胞系的培養上清液,通常是在細胞培養后的一段時間(如3-7天)進行收集。

確保在收集樣品前數天或至少在解凍后兩周內,沒有加入任何抗生素,以保證支原體在培養上清中的效價在PCR測定范圍之內。

樣品處理:

將收集到的培養上清液進行離心處理,以去除細胞碎片和其他雜質。

使用適當的緩沖液(如D-PBSA)重懸沉淀,并進行多次洗滌,以進一步純化樣品。

二、DNA提取

加熱處理:

將處理后的樣品加熱至一定溫度(如90°C)并保持一段時間(如15分鐘),以裂解細胞并釋放DNA

DNA抽提:

采用標準的DNA抽提方法(如酚/氯仿抽提法、乙醇沉淀法等)從樣品中提取DNA

注意避免交叉污染,確保DNA的純度。

三、PCR反應體系配置

準備反應液:

根據PCR試劑盒的說明或實驗室的標準流程,配置PCR反應液。

通常包括引物、dNTPsTaq DNA聚合酶、緩沖液等必要成分。

加入模板DNA

將提取的DNA作為模板加入到PCR反應液中。

注意控制DNA的加入量,避免過多或過少。

四、PCR擴增

設置PCR程序:

根據實驗需要設置合適的PCR擴增程序,包括預變性、變性、退火、延伸等步驟。

通常包括一個初始的預變性步驟(如95°C7分鐘),隨后是多個循環的變性(如95°C4秒)、退火(如65°C8秒)和延伸(如72°C16秒)步驟,每個循環的延伸時間可以逐漸增加。

進行PCR擴增:

將配置好的PCR反應液放入PCR儀中,按照設定的程序進行擴增。

注意監控PCR儀的運行狀態,確保擴增過程順利進行。

五、瓊脂糖凝膠電泳

制備瓊脂糖凝膠:

根據實驗需要制備適當濃度的瓊脂糖凝膠(如2%),并加入適量的電泳緩沖液。

點樣與電泳:

PCR擴增產物與適量的加樣緩沖液混合后,點樣到瓊脂糖凝膠的孔中。

在電泳儀上進行電泳,通常使用恒壓或恒流模式進行電泳。

六、結果分析

觀察電泳結果:

在紫外燈下觀察瓊脂糖凝膠上的電泳條帶。

注意比較樣品條帶與陽性對照、陰性對照條帶的位置和亮度。

判斷結果:

如果樣品條帶出現在陽性對照條帶相同的位置,且亮度相近或稍弱,則可判斷為支原體污染陽性。

如果樣品條帶未出現或位置與陽性對照條帶明顯不同,則可判斷為支原體污染陰性或假陰性。

需要注意的是,PCR檢測支原體污染具有高度的靈敏性和特異性,但也可能受到實驗條件、操作技術等多種因素的影響。因此,在進行PCR檢測時,應嚴格遵守實驗操作規程,確保實驗結果的準確性和可靠性。