新型實時NAT檢測法：高效、精準識別細胞培養中的支原體污染

細胞系的支原體污染是一種常見的情況，可能以多種方式影響細胞系的行為。支原體污染通常不明顯，因此應經常檢測細胞系。市面上有幾種用于支原體檢測的試劑盒，但歐洲藥典培養方法可能需要數周時間才能產生結果，仍被認為是“金標準”方法。因此，需要具有相當靈敏度、特異性和物種范圍的快速替代方法。在這里，我們描述了一種內部控制的基于Taqman的實時PCR檢測，用于細胞培養基，無需DNA提取。該測定可以檢測哺乳動物細胞培養物中最常見的支原體污染物的不到 10 CFU。經過驗證的檢測方法有可能用作基于細胞培養的生物制品生產中的常規測試。

在一項研究中，科研人員描述了一種新的實時檢測方法，該方法使用56種PCR引物的混合物直接從培養基中有效擴增多種支原體種類，而無需進行DNA提取。實時分析由Taqman探針介導至高度保守區域。使用另一種標記的Taqman探針至工程基因組DNA模板，以促進對抑制物質的管內控制。該方法顯示出高特異性、敏感性和檢測準確性。該方法有可能符合歐洲藥典（Ph. Eur.）2.6.7對于基于NAT的支原體檢測的要求，因此可能是對用于生物制品生產的細胞系進行培養測試的廉價、簡單且有效的替代方法。

歷史估計細胞系中支原體污染的發生率高達35%，但現在支原體污染受到的關注比以前更多了，因此這一估計可能過高了。然而，最近對DNA序列數據庫的計算機分析發現，美國國家生物技術信息中心（NCBI）序列讀取檔案中嚙齒動物和靈長類動物條目的11%被支原體序列污染，1000基因組項目中的樣本至少有7%被支原體污染，但尚不清楚污染是來自細胞培養還是實驗和數據處理步驟。

本研究的主要目的是提供驗證數據，以支持使用新開發的廣譜單管NAT（核酸擴增技術）檢測細胞培養物中支原體污染的方法。科研人員還尋求確定該檢測方法與傳統的瓊脂培養法（被廣泛認為是支原體檢測的金標準）相比，其性能是否相當。該研究使用德國MB公司生產的支原體檢測標準品進行試驗。