新型實(shí)時NAT檢測法：高效、精準(zhǔn)識別細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染

細(xì)胞系的支原體污染是一種常見的情況，可能以多種方式影響細(xì)胞系的行為。支原體污染通常不明顯，因此應(yīng)經(jīng)常檢測細(xì)胞系。市面上有幾種用于支原體檢測的試劑盒，但歐洲藥典培養(yǎng)方法可能需要數(shù)周時間才能產(chǎn)生結(jié)果，仍被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”方法。因此，需要具有相當(dāng)靈敏度、特異性和物種范圍的快速替代方法。在這里，我們描述了一種內(nèi)部控制的基于Taqman的實(shí)時PCR檢測，用于細(xì)胞培養(yǎng)基，無需DNA提取。該測定可以檢測哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中最常見的支原體污染物的不到 10 CFU。經(jīng)過驗(yàn)證的檢測方法有可能用作基于細(xì)胞培養(yǎng)的生物制品生產(chǎn)中的常規(guī)測試。

在一項(xiàng)研究中，科研人員描述了一種新的實(shí)時檢測方法，該方法使用56種PCR引物的混合物直接從培養(yǎng)基中有效擴(kuò)增多種支原體種類，而無需進(jìn)行DNA提取。實(shí)時分析由Taqman探針介導(dǎo)至高度保守區(qū)域。使用另一種標(biāo)記的Taqman探針至工程基因組DNA模板，以促進(jìn)對抑制物質(zhì)的管內(nèi)控制。該方法顯示出高特異性、敏感性和檢測準(zhǔn)確性。該方法有可能符合歐洲藥典（Ph. Eur.）2.6.7對于基于NAT的支原體檢測的要求，因此可能是對用于生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)測試的廉價、簡單且有效的替代方法。

歷史估計(jì)細(xì)胞系中支原體污染的發(fā)生率高達(dá)35%，但現(xiàn)在支原體污染受到的關(guān)注比以前更多了，因此這一估計(jì)可能過高了。然而，最近對DNA序列數(shù)據(jù)庫的計(jì)算機(jī)分析發(fā)現(xiàn)，美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）序列讀取檔案中嚙齒動物和靈長類動物條目的11%被支原體序列污染，1000基因組項(xiàng)目中的樣本至少有7%被支原體污染，但尚不清楚污染是來自細(xì)胞培養(yǎng)還是實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)處理步驟。

本研究的主要目的是提供驗(yàn)證數(shù)據(jù)，以支持使用新開發(fā)的廣譜單管NAT（核酸擴(kuò)增技術(shù)）檢測細(xì)胞培養(yǎng)物中支原體污染的方法。科研人員還尋求確定該檢測方法與傳統(tǒng)的瓊脂培養(yǎng)法（被廣泛認(rèn)為是支原體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)）相比，其性能是否相當(dāng)。該研究使用德國MB公司生產(chǎn)的支原體檢測標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行試驗(yàn)。