細胞傳代消化的問題

在消化的過程中，加入胰酶后，所有細胞都在被胰酶消化著，但是每個細胞的生長狀態是不一樣的，細胞的貼壁情況也是不一樣的，有的貼壁牢固，有的貼壁較松，這一點往往容易被忽視。對于較難消化或對胰酶敏感的細胞，可以采用四步消化法，具體操作如下:

第1步:不加胰酶，倒掉舊培養基加入少量新培養基洗1-2遍，(這是前奏，目的是將漂浮著的死細胞之類盡量洗掉。

第2步:加入少量新培養基直接吹打一遍，把貼壁不牢固的細胞吹打下來，再用培養基清洗一遍，兩次所得懸液混合傳入新瓶。(可以將這些傳入新瓶培養，與后面胰酶消化過的細胞生長狀態進行對比觀察即可知道該細胞對胰酶的敏感度。)

第3步:吸干凈瓶內剩余液體，加入2mIPBS潤洗一遍，吸掉棄之，再加入1ml左右的胰酶消化。消化的同時置于顯微鏡下觀察，待細胞與細胞之間間隙明顯的時候立即吸掉胰酶于干凈EP管備用，加入新培養基吹打2-3遍后吸取懸液于離心管或新瓶暫存。用2ml左右新培養基洗一遍與前面的混合(也可以傳入新瓶培養，以便與后面及前面的做對比)

第4步:把第三步吸出來的胰酶重新加入瓶內，繼續消化剩余的貼壁牢固的細胞(也可以用新的胰酶繼續鏡下觀察，待剩余細胞間隙明顯，細胞獨)，立開來的時候，吸掉胰酶，加入新培養基吹打，懸液傳入新瓶培養。

將細胞消化分成這幾步，除了是為了避免胰酶對細胞的損傷之外，還有一個更重要的作用就是，可以**程度地把細胞吹打成單個單個的狀態，不成片不連體。