DdmDE消除質(zhì)粒的分子機(jī)制 Ago是下一個(gè)CRISPR嗎

　　原核生物和侵襲性移動遺傳元件(MGEs)之間的進(jìn)化軍備競賽導(dǎo)致了各種宿主防御系統(tǒng)——如限制性修飾、CRISPR-Cas、Argonaute、CBASS(基于環(huán)寡核苷酸的噬菌體信號系統(tǒng))等等的出現(xiàn)，以抵御侵襲性移動遺傳元件(MGEs)的入侵，在消除入侵的MGE和塑造微生物群落和生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。由于許多分子基因工程工具都起源于原核基因組防御系統(tǒng)，因此了解原核免疫系統(tǒng)不僅對于揭示原核宿主- MGE相互作用的動力學(xué)至關(guān)重要，而且對于開發(fā)應(yīng)用于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)的分子工具也很有價(jià)值——看看如今的CRISPR技術(shù)就知道。

　　目前流行的霍亂弧菌菌株含有兩個(gè)DNA防御模塊DdmABC和DdmDE，它們合作消除質(zhì)粒，被認(rèn)為在第七次大流行的O1 El Tor (7PET)菌株的進(jìn)化成功中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。來自哥倫比亞大學(xué)的研究人員使用低溫電子顯微鏡來確定DdmDE防御質(zhì)粒的機(jī)制基礎(chǔ)。解旋酶-核酸酶DdmD采用自抑制二聚體結(jié)構(gòu)。原核Argonaute蛋白DdmE使用DNA向?qū)О邢蛸|(zhì)粒DNA。體內(nèi)突變研究證實(shí)了DdmDE復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，表明DNA與DdmE的結(jié)合會引發(fā)DdmD二聚體的分解，并將單體DdmD裝載到非靶DNA鏈上。體外研究表明，DdmD沿5′~ 3′方向易位，同時(shí)部分降解質(zhì)粒DNA。這些發(fā)現(xiàn)為了解DdmDE系統(tǒng)在質(zhì)粒消除中的機(jī)制提供了重要的見解。文章發(fā)表在新一期《Science》上。

　　DdmABC是一種類似lamasus的防御系統(tǒng)，被質(zhì)粒和噬菌體激活時(shí)可導(dǎo)致不產(chǎn)生有感染性病毒的頓挫感染(abortive infection)。 相比之下，DdmDE系統(tǒng)直接作用于小質(zhì)粒，導(dǎo)致其降解。結(jié)構(gòu)模型表明，DdmE是一種可能識別質(zhì)粒DNA的原核Argonaute (pAgo)蛋白，而DdmD編碼一種融合蛋白，該融合蛋白包含可以介導(dǎo)質(zhì)粒降解的解旋酶和核酸酶結(jié)構(gòu)域。這項(xiàng)研究目標(biāo)是探究DdmDE系統(tǒng)在質(zhì)粒消除中的機(jī)制，為將來改造為基因工具奠定基礎(chǔ)。

　　結(jié)果

　　DdmE是DNA引導(dǎo)的DNA靶向Ago

　　pAgo蛋白使用短核酸向?qū)碇笇?dǎo)核酸的識別和靶向。作者首先對828個(gè)pAgo序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，DdmE的多重序列比對和AlphaFold 2結(jié)構(gòu)建模顯示，在其PIWI結(jié)構(gòu)域中缺乏典型的DEDX催化四聚體，表明DdmE蛋白缺乏內(nèi)切酶活性，并表明與其他長a pAgo蛋白相比，DdmE不通過內(nèi)切酶催化的靶核酸切割發(fā)揮作用。數(shù)據(jù)表明，DdmE使用短的(<15 nt) 5 '磷酸化DNA作為tDNA結(jié)合的向?qū)А?/span>

　　質(zhì)粒消除需要DdmD的ATP酶和核酸酶活性

　　結(jié)構(gòu)模型預(yù)測DdmD含有N端超家族2 (SF2)解旋酶和c端PD-(D/E)XK核酸酶結(jié)構(gòu)域，這表明DdmD可能作為下游效應(yīng)物，在被DdmE招募和激活后降解質(zhì)粒DNA。值得注意的是，單獨(dú)使用DdmD對ssDNA質(zhì)粒具有顯著的降解活性，而單獨(dú)使用DdmD未觀察到質(zhì)粒dsDNA的降解，表明DdmD是一種有效的ssDNA核酸酶，需要DdmE激活并招募到其質(zhì)粒DNA靶點(diǎn)。DdmDE系統(tǒng)的活性包括DNA引導(dǎo)的DdmE靶向和依賴于腺苷三磷酸酶(ATPase)的核酸酶催化的DdmD質(zhì)粒降解。

　　DdmD受二聚化作用的自動抑制

　　為了深入了解解旋酶-核酸酶DdmD在DdmDE體系中的活性機(jī)制，作者利用單粒子冷凍電鏡(cryo-EM)確定了二聚體DdmD的原子結(jié)構(gòu)，表明DdmD是一種PD-(D/E) xk樣核酸酶，其催化活性對于DdmDE防御系統(tǒng)消除質(zhì)粒至關(guān)重要;DdmD以二聚體形式存在于自抑制狀態(tài)，這與在沒有DNA引導(dǎo)的DdmE的情況下，DdmD在體外dsDNA質(zhì)粒上不表現(xiàn)出核酸酶活性的觀察結(jié)果一致。

　　DNA引導(dǎo)的tDNA識別和DdmE招募DdmD

　　為了深入了解DdmE的分子結(jié)構(gòu)及其在DdmD激活中的作用，作者重組了一個(gè)帶有14-nt 5 '磷酸化DNA向?qū)У腄dmD-DdmE復(fù)合物和一個(gè)帶有錯(cuò)配非靶鏈的靶dsDNA，以促進(jìn)d環(huán)的形成。DdmDE復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表明，DdmD同型二聚體在與靶結(jié)合的DdmE相互作用時(shí)解體，形成1:1的異源二聚體，其中DdmE與gDNA-tDNA雙鏈結(jié)合，而DdmD與移位的非靶DNA (ntDNA)鏈結(jié)合。研究還表明tDNA結(jié)合的DdmE招募DdmD，DdmD-DdmE相互作用是支持其抗質(zhì)粒活性所必需的關(guān)鍵分子決定因素。

　　DdmE介導(dǎo)DdmD裝載到ntDNA鏈上

　　部分討論

　　研究闡明了支持的DdmDE系統(tǒng)的抗質(zhì)粒活性的分子機(jī)制：DdmE屬于催化活性不高的長-a- pAgo蛋白的亞支系，它使用5 ' -磷酸化的DNA向?qū)戆邢駾NA。解旋酶核酸酶DdmD最初由于自二聚化而處于自抑制狀態(tài)。tDNA與DdmE的結(jié)合將DdmD招募到ntDNA鏈上，誘導(dǎo)DdmD二聚體的分解。這反過來又啟動了DdmD通過ATP驅(qū)動的ntDNA降解，在5 '到3 '方向上的過程易位。

　　DdmDE的機(jī)制與I型CRISPR-Cas系統(tǒng)的分子機(jī)制有顯著的相似之處，在I型CRISPR-Cas系統(tǒng)中，RNA引導(dǎo)的效應(yīng)復(fù)合物Cascade將解旋酶-核酸酶融合蛋白Cas3招募到ntDNA鏈上。隨后，Cascade和Cas3保持在復(fù)合物中，而DNA被Cas3的解旋酶結(jié)構(gòu)域反復(fù)解旋，在DNA靶標(biāo)中產(chǎn)生短段的ssDNA。

　　鑒于I型CRISPR-Cas系統(tǒng)已被重新用作分子靶向技術(shù)，新研究表明，DdmDE可能被利用來通過遞送DNA來消耗細(xì)菌菌株，這些DNA將作為自我靶向向?qū)У膩碓础；贑RISPR-Cas9的類似方法已用于靶向致病的毒力基因，DdmDE可以用來產(chǎn)生自我消除質(zhì)粒，用于基于重組的基因組工程方法。新研究為DdmDE系統(tǒng)在原核生物基因組防御中的功能提供了基本的機(jī)制見解，并可能為利用它們作為新型抗菌或基因工程工具鋪平道路。

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