細胞培養(yǎng)時如何進行支原體污染的檢測

在細胞培養(yǎng)過程中，支原體污染的檢測至關重要，以確保實驗結果的準確性和可靠性。以下是支原體污染檢測的主要方法和步驟：

1.相差顯微鏡檢測

原理：支原體呈暗色微小顆粒位于細胞表面和細胞之間。

步驟：

將細胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶內的蓋玻片上。

24小時后取出，用相差油鏡觀察。

2.熒光染色法

原理：利用熒光染料使支原體DNA著色，通過熒光顯微鏡觀察。

熒光染劑Hoechst 33258檢測支原體污染的原理：染色劑會結合到DNA A-T富含區(qū)域，支原體A-T含量較高（55％~80％），因此可將其染色而檢測。

步驟：

制備標本：在六孔板中制備蓋玻片細胞培養(yǎng)物，接種待測細胞，培養(yǎng)1～2天。

固定：用新鮮配制的1：3冰醋酸/甲醇固定液固定15分鐘，重復固定一次，然后干燥。

染色：用Hoechst 33258熒光染液染色30分鐘，避光操作。

洗滌：用雙蒸水浸泡染色過的蓋玻片3次，每次3～5分鐘。

封片：滴加含50％甘油的檸檬酸緩沖液到染色過的細胞表面，然后封片。

觀察：在熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光分布狀態(tài)，判斷有無支原體污染及污染程度。

3.PCR法檢測支原體

原理：基于酶促DNA合成反應，擴增支原體DNA，檢測其存在。

步驟：

提取標本DNA（如酚氯仿法）。

使用特定引物和DNA聚合酶進行PCR擴增。

通過凝膠電泳或其他方法檢測PCR產(chǎn)物，確認支原體污染。

4.掃描電子顯微鏡法

原理：利用掃描電子顯微鏡直接觀察支原體。

特點：直觀、準確，但操作復雜，實驗周期長，常作為最后定性檢測。

5.DNA分子雜交檢測或支原體培養(yǎng)等方法

這些方法也可以用于檢測支原體污染，但具體步驟和原理因方法而異。

注意事項

在進行支原體污染檢測時，應使用無菌技術和適當?shù)姆雷o措施，以避免交叉污染。

選擇合適的檢測方法和步驟，根據(jù)實驗需求和條件進行選擇。

對于疑似支原體污染的細胞培養(yǎng)物，應及時采取措施進行處理，以避免對實驗結果產(chǎn)生不良影響。