qPCR標準曲線的建立步驟與原理

qPCR（實時定量聚合酶鏈式反應）標準曲線的建立步驟與原理如下：

步驟：

準備標準樣品：首先需要準備一系列已知濃度的標準樣品。這些標準樣品可以是純化的DNA或RNA，也可以是含有目標基因的質粒。

測量標準樣品濃度：為了準確測量標準樣品的濃度，可以使用比色法、熒光法或質譜法進行檢測。

制備標準曲線點：一旦確定了標準樣品的濃度，就可以按照一定的稀釋比例制備一系列標準曲線點。在定量PCR實驗中，通常會選擇一個稀釋系列，比如1:10、1:100、1:1000等，這樣可以確保標準曲線的線性范圍覆蓋待測樣品中目標基因的濃度范圍。

進行PCR擴增：將標準曲線點與待測樣品一起進行PCR擴增，得到擴增曲線。

原理：

qPCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。通過重復循環變性-退火-延伸三過程，可以獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。

在PCR擴增過程中，熒光信號的變化可以實時監測，并根據反應時間和熒光信號的變化繪制成一條曲線。這條曲線通常包括三個階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光信號指數擴增階段，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，因此可以通過檢測PCR產物的量來推斷模板最初的含量，從而實現定量分析。

在建立標準曲線時，利用一系列已知濃度的標準樣品進行PCR擴增，可以得到不同濃度下的擴增曲線。通過分析這些曲線，可以建立一條以標準樣品濃度為橫坐標、以某個特定循環數下的熒光信號值為縱坐標的標準曲線。這條標準曲線可以用于后續實驗中待測樣品中目標基因濃度的定量檢測。

總之，qPCR標準曲線的建立是基于PCR擴增原理和熒光信號實時監測技術的結合，通過利用已知濃度的標準樣品進行PCR擴增并繪制擴增曲線來建立標準曲線，進而實現對待測樣品中目標基因濃度的定量檢測。