我國藥典中對新生牛血清的要求有哪些

我國藥典中規定，新生牛血清是從出生14小時內未進食的新生牛采血分離血清，經除菌過濾后制成。牛血清生產過程中不得任意添加其他物質成分。新生牛血清應進行以下檢查，符合規定后方可使用。

如釆用經過驗證的病毒滅活工藝處理的牛血清，大腸埃希菌噬菌體及病毒檢測必須在滅活前取樣進行。

pH值：應為7.00~8.50。

蛋白質含量：采用雙縮脲法（通則0731第三法）或其他適宜方法測定，應為35~50g/L。

血紅蛋白：用分光光度法或其他適宜的方法測定，應不高于200mg/L。

滲透壓摩爾濃度：應為250~330mOsmol/kg（通則0632）。

細菌內毒素檢查：應不高于10EU/ml（通則1143凝膠限度試驗）。

支持細胞增殖檢查：采用傳代細胞（HFL1、Mv1 Lu、Vero和CHO）中的任意1種細胞及Sp2/0-Ag14細胞進行。細胞復蘇后，用待測樣品配制的培養液至少連續傳3代后使用，取對數生長期的細胞用于試驗。

（1）細胞生長曲線的測定   取供試品按10%濃度配制細胞培養液，Sp2/0-Ag14按每1ml含1×10^4的細胞濃度，其他貼壁細胞按2×104的細胞濃度接種細胞，每天計數活細胞，連續觀察1周，并繪制生長曲線。

（2）細胞倍增時間的測定   按生長曲線計算細胞的倍增時間。取細胞峰值前一天的細胞計數（Y）、接種細胞數（X）及生長時間（T）計算。

Sp2/0-Ag14細胞應不超過20小時；HFL1細胞應不超過22小時；Mv1 Lu細胞應不超過24小時；Vero細胞應不超過18小時；CHO細胞應不超過22小時。

（3）克隆率的測定   將細胞稀釋至每1ml含10個活細胞的濃度，按每孔1個細胞接種于96孔細胞培養板，每板至少接種60孔，于37℃、5%二氧化碳培養，定期觀察細胞克隆生長情況，培養1周后計數每孔中的細胞克隆數，并計算克隆率，應不低于70%。

式中   A為細胞克隆數；B為接種細胞的總孔數。

無菌檢查：依法則檢查（通則1101），應符合規定。

支原體檢查：依法則檢查（通則3301），應符合規定。

大腸埃希菌噬菌體：采用噬斑法和增殖法檢測。不得有噬菌體污染。

病毒檢查：

（1）樣品制備　取約250ml的新生牛血清供試品用于檢測，將其配制成含15%供試品的培養液，用于檢測全過程的細胞換液及傳代，以檢測合格的血清作為陰性對照血清。

（2）指示細胞制備　至少采用猴源（如Vero細胞）、2種牛源細胞（BT和MDBK細胞或無病毒污染的原代牛腎細胞）以及人二倍體細胞作為指示細胞，細胞復蘇后至少傳代1次后使用，根據所需量制備足夠量的細胞。

（3）用含有供試品的培養液將4種指示細胞分別接種于75cm2細胞培養瓶中，接種量應使細胞在培養7天后可達到至少80%～90%匯合。同時制備陰性對照血清培養瓶。將培養瓶置37℃、5%CO2培養箱中培養至少7天。可在第5天時換液一次。

（4）第7天進行第1次盲傳，將接種供試品及陰性對照的每種指示細胞培養瓶分別傳出至少2個75cm2培養瓶，繼續培養至第14天，在第12天時可換液一次。

（5）在第13天時（或第2次傳代前1天）或陰性對照瓶細胞達到至少70%匯合時，制備陽性對照用細胞。即取1個陰性對照細胞瓶分別傳至6孔板或其他適宜的細胞板中用于細胞病變觀察（CPE）、血吸附檢查（HAd）及熒光抗體檢測（IF），次日接種陽性對照病毒。

（6）第14天時進行第2次盲傳。將第1次傳代后的細胞培養物分別傳至6孔板或其他適宜的細胞板中，進行細胞病變觀察及HAd檢查時，接種于每種指示細胞上的待測樣本至少接種3孔；進行熒光抗體檢測時，接種于每種指示細胞上的待測樣本進行每種病毒檢測時至少接種2孔。繼續培養至少至第21天，剩余細胞樣本－60℃或以下保存備用。

（7）在第14天接種陽性對照病毒：取（5）制備的指示細胞接種適量陽性對照病毒，置36℃±1℃、5%CO2培養箱吸附2小時，吸棄上清液，加入適量細胞維持液，置36℃±1℃、5%CO2培養箱培養7天，對于BT細胞，BVDV可作為病變陽性對照，BPI3可作為HAd陽性對照，牛副流感病毒3型（PI3）、牛腺病毒（BAV-3）、牛細小病毒（BPV）以及牛腹瀉病毒（BVDV）可作為IF檢測陽性對照；對于MDBK細胞，呼腸孤病毒3型（REO3）和PI3可分別作為細胞病變及HAd檢查陽性對照，PI3、BAV-3、BVDV、REO-3為IF檢測陽性對照；對于Vero細胞，Pl3可作為細胞病變及HAd檢查陽性對照，PI3及REO-3作為IF檢測陽性對照。可不設立狂犬病病毒（Rabies）陽性對照。所有IF檢測陽性對照病毒應接種100～300CCID50。

（8）接種陰性對照及供試品的細胞培養物在接種后每日觀察細胞病變情況，在接種后至少21天或末次傳代后至少7天時分別進行病變觀察、HAd檢查及IF檢測，陽性對照培養物在接種后第7天或10%細胞出現CPE時可進行IF檢測。

進行血吸附檢查時，用雞與豚鼠血紅細胞在2～8℃及20～25℃進行檢測。

進行熒光抗體檢測時，將細胞固定后采用直接或間接免疫熒光抗體檢查法，至少應對BVDV、PI3、BAV-3、BPV、REO3以及 Rabies進行檢查，結果均應為陰性。

（9）結果判定　陰性對照應無細胞病變，血吸附檢查應為陰性，熒光抗體檢測應為陰性；陽性對照應有明顯的細胞病變，血吸附檢查應為陽性，熒光抗體檢測應為陽性，判為試驗成立。供試品如無細胞病變，血吸附檢查為陰性，且熒光抗體檢測為陰性，判定為符合要求。待測樣本如出現細胞病變，或血吸附檢查為陽性，或任何一種熒光抗體為陽性，則判定為不符合要求。

經病毒滅活處理的牛血清，滅活前取樣檢測后若任何一項檢測顯示為陽性，不建議用于生產。除非可鑒別出污染的病毒，且病毒滅活工藝驗證研究顯示其污染量可被有效滅活時方可使用，如果滅活前BVDV病毒檢測為陽性，滅活后還應取樣采用敏感的方法檢測BVDV，結果陰性為符合要求。

未經病毒滅活處理的牛血清若任何一項檢測顯示為陽性，則不得用于生產。

不能用感染試驗檢測的牛源性病毒可采用核酸檢測法，但應采用較大量的樣品提取核酸（如25～50ml的血清樣本），并計算合并血清的最低檢出限。