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熒光pcr檢測是什么？熒光pcr檢測技術(shù)方法介紹

2023-08-28 16:53

熒光PCR檢測技術(shù)是一種高靈敏度、高特異性的分子生物學(xué)檢測方法，廣泛應(yīng)用于疾病診斷、遺傳病、傳染病等領(lǐng)域。該技術(shù)通過在PCR反應(yīng)中加入熒光染料或熒光探針，實(shí)現(xiàn)在反應(yīng)過程中對熒光信號的實(shí)時監(jiān)測，從而實(shí)現(xiàn)對初始模板的定量分析。以下是熒光PCR檢測技術(shù)的方法介紹：

  1. 引物設(shè)計：根據(jù)目標(biāo)基因的序列，設(shè)計一對特異性引物，用于擴(kuò)增目標(biāo)基因片段。

  2. 模板制備：采集待檢測樣本，進(jìn)行核酸提取、純化等步驟，制備模板。

  3. 熒光染料或熒光探針加入：在PCR反應(yīng)體系中加入適量的熒光染料或熒光探針，以便在反應(yīng)過程中進(jìn)行熒光信號的實(shí)時監(jiān)測。

  4. PCR反應(yīng)：按照設(shè)定的PCR反應(yīng)條件，進(jìn)行熱循環(huán)擴(kuò)增目標(biāo)基因片段。

  5. 熒光信號監(jiān)測：在PCR反應(yīng)過程中，利用熒光信號監(jiān)測儀器，實(shí)時監(jiān)測反應(yīng)體系中的熒光信號強(qiáng)度。

  6. 數(shù)據(jù)分析：根據(jù)熒光信號強(qiáng)度和PCR反應(yīng)曲線，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計算出初始模板的拷貝數(shù)或濃度。

熒光PCR檢測技術(shù)根據(jù)化學(xué)發(fā)光原理可以分為非探針類和探針類。非探針類包括SYBR Green I染料法，而探針類包括TaqMan探針法和分子信標(biāo)法。

SYBR Green I染料法是一種通用型的熒光染料，它能夠與雙鏈DNA小溝結(jié)合，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，染料與擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合量逐漸增加，從而實(shí)現(xiàn)對擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。該方法操作簡便、成本低廉，但需要注意的是，SYBR Green I染料法會與非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，從而產(chǎn)生假陽性信號。

TaqMan探針法是一種更為特異、靈敏的熒光PCR方法，它使用一段帶有熒光標(biāo)記和淬滅標(biāo)記的寡核苷酸探針，探針的熒光標(biāo)記和淬滅標(biāo)記位于探針的同一端。在PCR反應(yīng)過程中，探針會與目標(biāo)基因特異性結(jié)合，并被酶切降解，從而釋放出熒光信號。TaqMan探針法具有高特異性、高靈敏度、可定量等優(yōu)點(diǎn)，但探針的合成和標(biāo)記成本較高。

分子信標(biāo)法是一種類似于TaqMan探針法的熒光PCR方法，它使用一段帶有熒光標(biāo)記和淬滅標(biāo)記的寡核苷酸片段，該片段的兩端分別與目標(biāo)基因的兩側(cè)序列特異性結(jié)合。在PCR反應(yīng)過程中，隨著目標(biāo)基因的擴(kuò)增，分子信標(biāo)會與擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合，從而釋放出熒光信號。分子信標(biāo)法具有高特異性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，但分子信標(biāo)的合成和標(biāo)記成本也較高。

總的來說，熒光PCR檢測技術(shù)是一種高靈敏度、高特異性的分子生物學(xué)檢測方法，具有操作簡便、可定量等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于疾病診斷、遺傳病、傳染病等領(lǐng)域，為臨床醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的工具。