常規(guī)細胞實驗大匯總（一）

細胞增殖實驗

MTT法：又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。

檢測原理：

活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲臜，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。

用途：廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。

特點：靈敏度高、經(jīng)濟。

CCK-8法：又稱細胞增殖和細胞毒性實驗。

檢測原理：

該試劑中含有WST-8，在電子載體1-Methoxy PMS的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲臜物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。

用途：廣泛用于藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗等。

特點：對細胞毒性小，可以多次測定選取**測定時間；檢測迅速；靈敏度高

BrdU法：直接測定進行分裂的細胞數(shù)來評價細胞增殖能力。

檢測原理：

用BrdU預處理的細胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入復制的DNA雙鏈中，而且這種置換可以穩(wěn)定存在，并帶到子代細胞中。細胞經(jīng)過固定和變性處理后，可用免疫學方法檢測DNA中BrdU的含量(如采用鼠抗BrdU單克隆抗體特異識別BrdU,再采用辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠IgG二抗標記，最后用比色法或熒光的方法進行定量測定)，從而判斷細胞的增殖能力。

用途：可判斷增殖細胞的種類，增殖速度，對研究細胞動力學有重要意義。

特點：簡單、快速、安全，檢測的敏感性好；適合于大塊組織的快速檢查，尤適于定量研究；BrdU既可用于活體標記，亦可用于細胞或組織細胞增殖、分化的標記。副作用低；此方法的缺點是標記時間較短。

檢測原理：

EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖時期代替T滲入正在復制的DNA分子，通過基于EdU與熒光染料的特異性反應檢測DNA復制活性，通過檢測EdU標記便能準確地反映細胞的增殖情況。與BrdU檢測方法相比，EdU檢測方法更快速、更靈敏、更準確。EdU檢測染料只有BrdU抗體大小的1/500，在細胞內(nèi)很容易擴散，無需DNA變性（酸解、熱解、酶解等）即可有效檢測，可有效避免樣品損傷，在細胞和組織水平能更準確地反映細胞增殖等現(xiàn)象。

用途：在細胞水平上EdU對增殖細胞的標記，對植物增殖細胞進行標記并檢測、細胞示蹤實驗等。

特點：EdU法檢測細胞增殖，無需抗體，無變性步驟，保持細胞形態(tài)和DNA完整性。

細胞凋亡

磷脂酰絲氨酸外翻分析：又叫做Annexin V法，常用來檢測細胞凋亡。

檢測原理：

磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進行熒光素(FITC、PE)或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。

用途：用于區(qū)分早期凋亡的細胞與晚期凋亡加壞死的細胞。最適合懸浮培養(yǎng)的細胞。

特點：某些細胞的細胞膜外表面帶有大量的PS，因而也不能使用該方法(比如巨核細胞、血小板、某些骨髓系細胞)；靈敏度高、方便快捷；只適用于活細胞，不能用能破壞細胞膜完整性的固定劑和穿透劑固定或穿膜。