常規(guī)細(xì)胞實驗大匯總（一）

細(xì)胞增殖實驗

MTT法：又稱MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。

檢測原理：

活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

用途：廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。

特點：靈敏度高、經(jīng)濟。

CCK-8法：又稱細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性實驗。

檢測原理：

該試劑中含有WST-8，在電子載體1-Methoxy PMS的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進行細(xì)胞增殖和毒性分析。

用途：廣泛用于藥物篩選、細(xì)胞增殖測定、細(xì)胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗等。

特點：對細(xì)胞毒性小，可以多次測定選取**測定時間；檢測迅速；靈敏度高

BrdU法：直接測定進行分裂的細(xì)胞數(shù)來評價細(xì)胞增殖能力。

檢測原理：

用BrdU預(yù)處理的細(xì)胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入復(fù)制的DNA雙鏈中，而且這種置換可以穩(wěn)定存在，并帶到子代細(xì)胞中。細(xì)胞經(jīng)過固定和變性處理后，可用免疫學(xué)方法檢測DNA中BrdU的含量(如采用鼠抗BrdU單克隆抗體特異識別BrdU,再采用辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗標(biāo)記，最后用比色法或熒光的方法進行定量測定)，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。

用途：可判斷增殖細(xì)胞的種類，增殖速度，對研究細(xì)胞動力學(xué)有重要意義。

特點：簡單、快速、安全，檢測的敏感性好；適合于大塊組織的快速檢查，尤適于定量研究；BrdU既可用于活體標(biāo)記，亦可用于細(xì)胞或組織細(xì)胞增殖、分化的標(biāo)記。副作用低；此方法的缺點是標(biāo)記時間較短。

檢測原理：

EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖時期代替T滲入正在復(fù)制的DNA分子，通過基于EdU與熒光染料的特異性反應(yīng)檢測DNA復(fù)制活性，通過檢測EdU標(biāo)記便能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的增殖情況。與BrdU檢測方法相比，EdU檢測方法更快速、更靈敏、更準(zhǔn)確。EdU檢測染料只有BrdU抗體大小的1/500，在細(xì)胞內(nèi)很容易擴散，無需DNA變性（酸解、熱解、酶解等）即可有效檢測，可有效避免樣品損傷，在細(xì)胞和組織水平能更準(zhǔn)確地反映細(xì)胞增殖等現(xiàn)象。

用途：在細(xì)胞水平上EdU對增殖細(xì)胞的標(biāo)記，對植物增殖細(xì)胞進行標(biāo)記并檢測、細(xì)胞示蹤實驗等。

特點：EdU法檢測細(xì)胞增殖，無需抗體，無變性步驟，保持細(xì)胞形態(tài)和DNA完整性。

細(xì)胞凋亡

磷脂酰絲氨酸外翻分析：又叫做Annexin V法，常用來檢測細(xì)胞凋亡。

檢測原理：

磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進行熒光素(FITC、PE)或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。

用途：用于區(qū)分早期凋亡的細(xì)胞與晚期凋亡加壞死的細(xì)胞。最適合懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞。

特點：某些細(xì)胞的細(xì)胞膜外表面帶有大量的PS，因而也不能使用該方法(比如巨核細(xì)胞、血小板、某些骨髓系細(xì)胞)；靈敏度高、方便快捷；只適用于活細(xì)胞，不能用能破壞細(xì)胞膜完整性的固定劑和穿透劑固定或穿膜。