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支原體常規檢測方法匯總(一)

2021-11-19 16:15來源:威正翔禹|締一生物

小伙伴們晚上好!


轉眼又到周五了,本周最后一個工作日,我們整點干貨內容,來聊聊,支原體的常規檢測方法



養細胞的小伙伴,最怕遇到的,大概就是細胞污染了。

這細菌和真菌污染好辨別,處理起來雖然麻煩,但也不是毫無辦法。相比起來,支原體污染才是防不勝防


顯微鏡很難捕捉到它們的身影,與細胞共存在同一培養體系下,還跟細胞搶吃搶喝。可憐弱小又無助的細胞根本不是支原體的對手,只能茍延殘喘,狀態一代不如一代,導致實驗結果出現偏差


多數情況下,發現細胞疑似支原體污染,直接丟掉然后清理環境即可。但在一些特殊實驗,比如:細胞保種、抗體藥生產、疫苗生產或是細胞治療過程中,則需要對細胞例行支原體檢測,以確保細胞的純凈。


支原體常規檢測法之經典法


這里指的是基于經典法試劑盒:Venor?Gem qEP的檢測方法。



關于qPCR大家應該都不陌生:


實時熒光定量PCR

Quantitative Real-time PCR



是一種在DNA擴增反應中,以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。


在支原體經典法檢測試劑盒中,無需RNA提取和反轉錄步驟,樣品僅需待檢測的細胞上清或是從上清中提取的DNA


經典法試劑盒:Venor?Gem qEP使用方法


一、樣品制備:


①濃縮:當細胞長至90%時,即可收集上清開始檢測,可對樣品進行適當濃縮

注:濃縮僅適用于支原體的完整性,避免濃縮前支原體被破壞(如熱滅活)。



②穩定:細胞培養樣品可能含有豐富的DNA酶,在低溫下也能降解支原體DNA。因而推薦進行樣品穩定化處理。如果立即進行DNA抽提,則忽略這一步。

③DNA 抽提大量證據表明,DNA抽提可實現最高的靈敏度。DNA抽提有多種方法,但應適合支原體基因組。我們推薦:

Venor?GeM Sample Preparation kits (貨號56-1010/-1050/-1200) 適合手動DNA抽提

這些DNA抽提試劑盒已經過大量驗證,具體流程參見試劑盒說明書。另外Venor?GeM qEP kit包含的內控DNA對照,也用于驗證DNA抽提步驟(內控原理:已知濃度的細胞,包含內部控制DNA序列,該序列不和現有的任何有機體序列同源,對檢測的DNA樣品干擾極小。在DNA提取前,將該內控細胞和樣品一起加入細胞裂解液中,被一起提取出來。和靶點樣品一起進行熒光定量PCR實驗,內控DNA序列的成功擴增提示靶點DNA的提取成功)


二、試劑制備與PCR


注:具體參數設置可點擊閱讀原文,登錄締一官方網站進行查詢


另外,下列儀器已經通過PCR反應驗證:


三、試劑制備與PCR



FAM通道檢測支原體熒光信號。依據DNA標準曲線和Ct值定量。具體步驟需參考具體qPCR 儀及軟件的功能。我們推薦對包括對照在內的每個樣品的擴增曲線進行評估


Ct<40為陽性結果。Ct≥40為陰性結果。支原體DNA和內控DNA存在信號的競爭性抑制。支原體DNA越多,FAM通道信號越高,檢測內控對照的HEX通道信號越低。



關于經典法qPCR檢測支原體的方法今天就介紹到這里啦,了解更多商品詳情可以點擊下方圖片,進入我們的官方商城,也可點擊文末的閱讀原文,瀏覽官方網站~



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