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支原體qPCR檢測的結果詮釋

2020-12-01 16:12來源：威正翔禹|締一生物


支原體qPCR檢測不僅用于細胞培養的支原體篩查，也用于生物制品行業的放行檢測，但前提是要有方法驗證。

無論是否遵循藥典，支原體qPCR檢測的結果判定都需要一定的標準。下面小編結合德國MB廠家的支原體qPCR說明書及相關文件，給予進一步的闡釋。


一、熒光檢測通道的結果詮釋

用MB公司的qPCR試劑盒檢測時，qPCR儀的FAM通道檢測支原體熒光信號，HEX通道檢測內控對照（簡稱IC）的熒光信號（如沒有HEX通道，可用VIC通道）。IC是用于監測qPCR反應是否正常。對于這兩個通道，Ct＜40為陽性結果。Ct≥40為陰性結果。支原體DNA和IC存在信號的競爭性抑制。

在陰性對照和陽性對照均結果正常的前提下，根據FAM?通道和HEX通道的檢測結果，可判別樣品是否有支原體污染。具體見下表：


表1. FAM?通道
(支原體) 和HEX? (IC) 通道的結果詮釋


檢測支原體

FAM?通道

內控對照

HEX?通道

結果說明

+

+或-

支原體陽性

-

-

結果無效，需重新檢測

-

+

支原體陰性



需要說明的是：

內控對照可在支原體DNA抽提時加入。如果結果無效，則說明抽提失敗，或者qPCR存在抑制。如果內控對照是在qPCR反應時加入，則說明qPCR存在抑制。


二、對照與樣品的結果詮釋（適用于符合EP/JP的檢測）

對于遵循EP/JP的檢測，具體數據詮釋見表2。


樣本

結果

意義

進一步的行動

無模板對照

陰性

PCR有效

分析樣本數據


陽性

PCR有污染

再重復PCR，檢查污染來源（如預混液、水、儀器）

陽性對照

陰性

PCR失敗

重復PCR，檢查反應失敗原因（如漏加試劑、試劑陳舊、加樣錯誤，PCR程序錯誤）


陽性

PCR有效

分析樣本數據

陰性對照

陰性

PCR有效

分析樣本數據


陽性

抽提或PCR有污染

重復抽提和PCR，檢查污染來源（如緩沖液、預混液、水、儀器），同時，如果無模板對照為陽性，應考慮為PCR污染，應再重復PCR

樣本

陰性（0/2）

無污染

生物制品放行


陽性（1/2）

可能有污染

包括抽提在內的全部過程需要重復以評估潛在污染。如果同時無模板對照為陽性，考慮為PCR污染，應再重復實驗。模棱兩可的結果會影響產品放行。


陽性（2/2）

有污染

生物制品不放行



表2.結果判定的前提是：qPCR檢測試劑盒符合EP/JP的要求。



三、MB公司支原體qPCR試劑盒(經典法)

德國MB公司的支原體qPCR檢測試劑盒(經典法)(英文名：Venor?Gem qEP)經過廠家全面的方法驗證，符合歐洲藥典/日本藥典要求，適合細胞治療，CAR-T，抗體藥、疫苗等臨床項目申報和質檢。

需注意樣本要先做DNA抽提，再進行qPCR檢測。MB還提供用于PCR/qPCR方法驗證的配套的支原體10CFU、100CFU菌株標準品、特異性驗證用支原體基因組DNA和細菌基因組DNA、支原體DNA絕對定量標準品（基因組拷貝數經嚴格標定）。


四、德國MB公司介紹

德國MB公司，全稱Minerva Biolabs，是世界**的微生物污染控制公司，成立于1999年，總部位于德國柏林。

公司創始人來自于全球聞名的羅伯特?科赫微生物研究所。

二十年來，MB公司專注于微生物污染檢測與清除，

特別是支原體和軍團菌的技術和產品，在世界上遙遙領先。

1.自1999年起即研發細胞培養和生物藥工業用QC檢測試劑

2.配備生物安全二級實驗室

3.GMP級潔凈車間生產

4.世界**的支原體PCR檢測試劑供應商

5.IOM和PDA成員

6.ISO 9001和ISO 13485認證


注：IOM全稱Institute of Medicine

PDA全稱Parenteral Drug Association



2007年，上海威正翔禹生物科技有限公司作為MB公司的全國總代理，將支原體檢測防控的優秀產品引入中國。十幾年來，不斷為中國生物研究實驗室，以及眾多生物制藥企業，提供了完整高效的支原體等微生物檢測及祛除解決方案。


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