MB公司支原體標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)控

生物制品和細胞治療企業(yè)已越來越多地采用核酸法進行支原體的檢查和生產(chǎn)質(zhì)控。核酸法如替代藥典方法，則需進行方法驗證。

德國MB公司出品有一系列常見支原體或支原體基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)品，包括靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品（10CFU,100CFU）、特異性標(biāo)準(zhǔn)品以及PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品，其中靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品也可用于耐用性的驗證。

MB廠家具有ISO 9001和ISO 13485質(zhì)量體系認(rèn)證。每個批次支原體標(biāo)準(zhǔn)品都有驗證和質(zhì)控。同時支原體培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基每個批次都符合歐洲藥品質(zhì)量管理局（EDQM）的標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)品每個批次都提供有質(zhì)控證書（COA）。標(biāo)準(zhǔn)品所用的支原體菌株來自英國NCTC菌種保藏中心，同時具有相應(yīng)的ATCC編號。

下面對MB廠家的三類標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)控方面做一介紹。

（一）支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品

10CFU?支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品為滅活支原體，這樣不會對實驗室造成支原體污染。它用于核酸法的靈敏度和耐用性驗證。它每盒含3管10CFU支原體凍干粉，2管陰性對照。靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品主要經(jīng)過下列三方面的質(zhì)控：

1. 功能檢測：

即標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶后作DNA抽提（采用MB公司的Venor?GeM Sample Preparation Kit），再用符合藥典標(biāo)準(zhǔn)的qPCR試劑盒檢測，應(yīng)保證有擴增曲線。

2. 活力檢測：

即標(biāo)準(zhǔn)品在培養(yǎng)基中復(fù)溶并培養(yǎng)7天后，再進行DNA抽提和qPCR檢測，Ct值和對照組比，應(yīng)不超過允許閾值（ΔCt >2）。該檢測主要是確保支原體均已滅活。

3.最低閾限檢測和批次合格標(biāo)準(zhǔn)：

標(biāo)準(zhǔn)品用DMEM+5%FCS進行10倍梯度稀釋，形成3個稀釋度，DNA抽提后然后進行前后3輪qPCR檢測，每輪每個稀釋度重復(fù)8次。每種支原體的Ct平均值應(yīng)達到一定標(biāo)準(zhǔn)，方為合格。

（二）支原體基因組DNA——特異性驗證用

該基因組DNA是從相應(yīng)的支原體中抽提出來，并制成凍干粉。每管為10ng左右。復(fù)溶時，每管加100ml廠家提供的Tris緩沖液，室溫靜置5分鐘，再渦旋離心5秒鐘。

廠家對基因組中的16S rRNA片段進行了序列分析，要求應(yīng)與相應(yīng)支原體物種的同源性應(yīng)達到99%以上。對制備的DNA質(zhì)量和數(shù)量進行了熒光分析和PCR擴增。PCR擴增應(yīng)顯示為單一的擴增條帶。

（三）PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品

每管為1x108拷貝的支原體物種基因組DNA凍干粉，使用時也是先用廠家提供的Tris緩沖液復(fù)溶。質(zhì)控時，對16S rRNA的部分序列進行測序分析，以鑒定支原體物種，測序結(jié)果應(yīng)顯示為99%以上的同源性。再對該標(biāo)準(zhǔn)品作系列梯度稀釋，再進行qPCR擴增，應(yīng)顯示為良好的線性。該方法還可確定qPCR方法的檢測閾值。

圖. 肺炎支原體DNA定量標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后的擴增曲線。DNA的量為2X105——2個拷貝。

MB公司的上述三類標(biāo)準(zhǔn)品可用于對支原體核酸法的方法學(xué)驗證，包括靈敏度、特異性和耐用性。其中，基因組DNA除了包括常見支原體物種外，還包括一些常見細菌，用于驗證常規(guī)PCR或qPCR的檢測是否會產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

總之，良好的質(zhì)控是標(biāo)準(zhǔn)品品質(zhì)的保證，這樣才能確保方法驗證結(jié)果的可靠性，使支原體的核酸法檢測符合藥典所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，從而為替代培養(yǎng)法等經(jīng)典支原體的檢測方法提供數(shù)據(jù)支持。

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德國MB公司簡介：

德國MB公司，全稱Minerva Biolabs，是世界**的微生物污染控制公司，成立于1999年，總部位于德國柏林。MB公司具有ISO 9001和ISO 13485體系認(rèn)證。

公司創(chuàng)始人來自于全球聞名的羅伯特?科赫微生物研究所。

二十年來，MB公司專注于微生物污染檢測與清除，

特別是支原體和軍團菌的技術(shù)和產(chǎn)品，在世界上遙遙領(lǐng)先。

*   自1999年起即研發(fā)細胞培養(yǎng)和生物藥工業(yè)用QC檢測試劑

*   配備生物安全二級實驗室

*   GMP級潔凈車間生產(chǎn)

*   世界**的支原體PCR檢測試劑供應(yīng)商

*   IOM和PDA成員

*   ISO 9001和ISO 13485認(rèn)證

注：IOM全稱Institute of Medicine

PDA全稱Parenteral Drug Association

2007年，上海威正翔禹生物科技有限公司作為MB公司的全國總代理，將支原體檢測防控的優(yōu)秀產(chǎn)品引入中國。十幾年來，不斷為中國生物研究實驗室，以及眾多生物制藥企業(yè)，提供了完整高效的支原體等微生物檢測及祛除解決方案。