科學(xué)家開發(fā)出高通量檢測單細(xì)胞mRNA動態(tài)變化的新技術(shù)scNT-seq

細(xì)胞命運轉(zhuǎn)變以及響應(yīng)外界信號的過程中會改變細(xì)胞類型特異（cell-type-specific）的基因表達(dá)，而基因表達(dá)的豐度(total RNA level)是由mRNA轉(zhuǎn)錄、加工、降解等過程共同決定的。

在含有多種細(xì)胞類型的復(fù)雜組織和系統(tǒng)中，在單細(xì)胞水平準(zhǔn)確測定這些 mRNA動態(tài)變化過程對于理解基因表達(dá)調(diào)控的重要性不言而喻。

傳統(tǒng)的mRNA代謝標(biāo)記技術(shù)利用尿苷類似物4-硫尿苷（4sU）可以有效的標(biāo)記新生mRNA，但是技術(shù)上的局限性不能達(dá)到單細(xì)胞分辨率；而常規(guī)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)雖然可以揭示不同細(xì)胞類型的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄組，但是不能精確分辨特定時間里新生成的和已有的mRNA，因此用于定量研究細(xì)胞類型特異的mRNA動態(tài)調(diào)控機制十分困難。

為了應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，美國賓夕法尼亞大學(xué)吳昊實驗室開發(fā)了一種高通量檢測單細(xì)胞mRNA動態(tài)變化的新方法， scNT-seq（全稱single-cell metabolically labeled new RNA tagging sequencing）。

該方法創(chuàng)新性的整合了mRNA代謝標(biāo)記 (metabolic labeling)，基于液滴微流控（droplet microfluidics）的高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)和最近開發(fā)的4sU化學(xué)轉(zhuǎn)化反應(yīng) （chemically recode 4sU to cytosine analog）；在數(shù)據(jù)分析方面，作者構(gòu)建了基于unique molecular identifier (UMI) 的統(tǒng)計模型來更加準(zhǔn)確地分析單細(xì)胞水平上新生成的mRNA的比例。

北京時間2020年8月31日晚23時，Nature Methods雜志在線發(fā)表了文章 “Massively parallel and time-resolved RNA sequencing in single cells with scNT-seq”。

作者應(yīng)用這一技術(shù)解析了小鼠神經(jīng)元快速激活過程中的單細(xì)胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并預(yù)測細(xì)胞狀態(tài)變化軌跡，他們還進(jìn)一步研究了不同胚胎干細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換過程中的mRNA動態(tài)變化的調(diào)控機制。

scNT-seq具體技術(shù)流程如下：首先將4sU添加到培養(yǎng)基中用來標(biāo)記細(xì)胞中新生成的mRNA（圖1第1步）。為了在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中區(qū)分含有4sU標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄本，將4sU化學(xué)轉(zhuǎn)化反應(yīng)整合到液滴微流控 (Drop-seq) 流程中（圖1第2-4步）。

由于捕獲mRNA的barcoded beads具有區(qū)分不同轉(zhuǎn)錄本的UMI序列，相比較沒有UMI的單細(xì)胞分析技術(shù)（e.g. scSLAM-seq），該方法不僅可以消除由于PCR擴增帶來的誤差，而且相對于單個mRNA分子而言能增加T-to-C的覆蓋度（圖1第5-8步）。

最后，利用基于UMI的二項式混合分布來準(zhǔn)確估計每個細(xì)胞中單個基因的新生轉(zhuǎn)錄本。（圖1第9步）

圖2 利用scNT-seq技術(shù)研究小鼠大腦皮層神經(jīng)元中神經(jīng)活性調(diào)控的轉(zhuǎn)錄動態(tài)。

前人的研究表明，神經(jīng)元激活后可以快速誘導(dǎo)（幾分鐘到幾小時內(nèi)）幾百個特異基因表達(dá)，這些基因被稱為神經(jīng)活性調(diào)節(jié)的基因（Activity-regulated genes， ARGs）。

利用ARGs被神經(jīng)活性快速誘導(dǎo)而在靜息狀態(tài)下幾乎不表達(dá)的特點，可用其評估scNT-seq技術(shù)檢測新生成mRNA的可靠性。作者用4sU標(biāo)記原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞，其間用氯化鉀（KCl）激活這些細(xì)胞（15-120分鐘）（圖2a）。

作者首先將大腦皮層神經(jīng)元聚類成不同細(xì)胞類型，包括興奮性神經(jīng)元（Ex）、抑制性神經(jīng)元 (Inh)、神經(jīng)元前體細(xì)胞（NP）等（圖2b）。接下來他們分析了不同細(xì)胞類型中，ARGs基因中（如Jun和Npas4基因，圖2c）新（new RNAs，產(chǎn)生于4sU標(biāo)記的2小時內(nèi)）和舊（old RNAs，產(chǎn)生于2小時前）轉(zhuǎn)錄本在不同細(xì)胞類型中的表達(dá)水平。

這些ARGs的new RNAs在不同細(xì)胞類型中有不同程度的響應(yīng)，而old RNAs沒有明顯響應(yīng)（合成于4sU標(biāo)記和神經(jīng)元激活前），說明scNT-seq可以準(zhǔn)確區(qū)分新舊轉(zhuǎn)錄本。

在準(zhǔn)確區(qū)分新、舊轉(zhuǎn)錄本的基礎(chǔ)上，作者運用新近開發(fā)的Dynamo算法程序在興奮性神經(jīng)元中進(jìn)行了基于mRNA代謝標(biāo)記的RNA velocity分析（圖2d右側(cè)），能準(zhǔn)確捕獲神經(jīng)元激活早期（0 – 15min）和晚期（30 – 120 min）的變化。

相較之下，傳統(tǒng)的RNA velocity利用已拼接（無內(nèi)含子）和未拼接（有內(nèi)含子）的轉(zhuǎn)錄本信息來間接地預(yù)測細(xì)胞中基因表達(dá)的變化趨勢。

由于Jun， Fos等早期響應(yīng)基因內(nèi)含子長度較短，基于內(nèi)含子/外顯子定量的傳統(tǒng)RNA velocity方法無法準(zhǔn)確估計這些基因的動態(tài)變化，因此無法鑒定到神經(jīng)元激活早期（0 – 15min）的變化 (圖2d左側(cè)）。

而基于新生成轉(zhuǎn)錄本的RNA velocity能夠直接利用實驗準(zhǔn)確定量的新、舊轉(zhuǎn)錄本的信息，推測mRNA的動態(tài)變化，不受基因結(jié)構(gòu)（內(nèi)含子比例）影響，兼具準(zhǔn)確性和適用性。

細(xì)胞中RNA的豐度由轉(zhuǎn)錄、加工、降解等過程共同決定，準(zhǔn)確測定細(xì)胞群體中稀有或動態(tài)變化的細(xì)胞類型中mRNA合成和降解速率是一個重要而充滿挑戰(zhàn)的問題。

前人的研究表明，小鼠胚胎干細(xì)胞存在不同的干細(xì)胞狀態(tài)，其中大約1%的細(xì)胞會自發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂懈叻只瘽摿Γ╰otipotent）的“2C-like”狀態(tài)（2-cell embryos like state）。

作者通過pulse-chase的標(biāo)記策略結(jié)合scNT-seq技術(shù)測定了2616個基因在不同細(xì)胞狀態(tài)中的降解速率（half-life，圖3a，b）。

結(jié)合4小時4sU標(biāo)記實驗，作者測定了445個差異表達(dá)基因的合成和降解速率。根據(jù)mRNA合成速率和降解速率在不同細(xì)胞狀態(tài)間變化的趨勢，這些基因可以劃分為3種不同的mRNA豐度調(diào)節(jié)策略（圖3c）。

有意思的是，即使采用同一種調(diào)控策略的基因，mRNA合成和降解對于不同基因mRNA豐度調(diào)節(jié)的貢獻(xiàn)也不盡相同。例如Tet1和Lefty2基因都采用“Destabilizing”策略（mRNA合成和降解速率同向變化），但是Tet1基因主要通過降低合成速率（synthesis rate）降低2C-like細(xì)胞中mRNA豐度，而Lefty2基因主要通過提高降解速率（degradation rate）降低2C-like細(xì)胞中mRNA豐度（圖3c）。

總的來說，scNT-seq是一種能在單細(xì)胞水平準(zhǔn)確定量新生轉(zhuǎn)錄本的新技術(shù)。和已有的單細(xì)胞代謝標(biāo)記分析方法[ref 3]相比，這項新技術(shù)兼具高準(zhǔn)確度，高通量和低成本等優(yōu)勢。

因此，scNT-seq與Jay Shendure實驗室的曹俊越博士新近開發(fā)的sci-fate技術(shù)，都能夠廣泛應(yīng)用于分析大量單細(xì)胞在細(xì)胞命運決定和分化，外界信號響應(yīng)，及疾病模型等動態(tài)過程中mRNA表達(dá)調(diào)控等相關(guān)的重要生物學(xué)問題。