細胞狀態(tài)不好，你排除過支原體嗎？(下）

   細胞培養(yǎng)過程中，由于實驗環(huán)境、操作者鼻腔口腔、實驗器材等很多地方都有支原體的存在。因此，細胞發(fā)生支原體污染的頻率很高。

       據(jù)美國數(shù)據(jù)統(tǒng)計，細胞發(fā)生支原體污染的幾率在70%以上。

       同時，由于支原體直徑很小，僅在180nm~350nm之間，只有通過電鏡才能看到。因此，支原體污染不易被實驗者肉眼發(fā)覺。

       而支原體污染是個循序的過程，普通抗生素對其無效。因此，被支原體污染的細胞會持續(xù)受到影響，導致實驗數(shù)據(jù)不準確。

      為什么有些細胞實驗無法重復？

      為什么有的細胞在相當長的時間里，都養(yǎng)不到**狀態(tài)？

      為什么實驗室中，超過一株以上的細胞都時好時壞？

      支原體污染是一個很重要的原因！

       在本公眾號上周《細胞狀態(tài)不好，你排除過支原體嗎(上)》這篇文章里，筆者詳述了細胞被支原體污染的癥狀及檢測方法。

       本期文章中，我們將進一步介紹細胞被支原體污染后，徹底清除支原體的方法。

細胞被支原體污染，解決方案

方法一：確認細胞已被支原體污染，終止試驗，丟棄所有被污染的細胞和耗材。

       重新復蘇細胞，注意選用未被污染的細胞株、血清和培養(yǎng)基，并規(guī)范操作。

方法二：對于珍貴的，樣品不可再得的細胞，或價格昂貴的種子細胞，不但無法丟棄，而且作為種子細胞，還需要徹底根除支原體污染。

      此時，需選用特異性的支原體殺除劑，清除污染，保護細胞。

      目前世界上最有效的方法是是德國的一款**生物試劑，由Minerva公司生產，品名Mynox^?。

      此試劑可在2-3小時內將支原體主動殺除，但對細胞無毒害作用。特別適合細胞保種。

      Mynox^?為枯草桿菌中提取出的生物制劑，加入培養(yǎng)液中，可特異性地與支原體膜結合，改變膜通透性。通過此生物物理的方法，2～3小時內，即可把細胞中的支原體殺除掉。因為細胞膜結構與支原體膜不同，故Mynox^?不會與細胞膜結合，因此無細胞毒性。

       注意：3小時后，需將此試劑洗脫，將細胞更換到新的培養(yǎng)耗材和培養(yǎng)液中，重新培養(yǎng)。

       此時，不應使用PCR方法檢測細胞中支原體。由于支原體解體，故PCR結果為假性強陽性。

具體操作流程見下圖：

Mynox^?祛除貼壁細胞中支原體的流程圖

Mynox^?殺除支原體功能強大有效，但由于價格昂貴，上圖中使用的200ul人民幣要5000元左右，使得應用于細胞保種的數(shù)量受到價格的限制。

方法三：對于已耗費很多時間，大量擴增起來的細胞，或經(jīng)過基因轉染、體外刺激等大量工作處理過的細胞，如果發(fā)現(xiàn)細胞被支原體污染了，怎么辦？此時由于前期工作量巨大，使操作人員無法丟棄已有細胞。

但由于價格原因，又無法使用方法二提到的昂貴試劑殺除細胞上的支原體，

同時，實驗人員還需要清除細胞上的支原體污染，讓實驗得以往下推進，以最終獲得準確的實驗數(shù)據(jù)。

此時，實驗者可選用對支原體特效的抑制劑，通過對細胞的前期處理，中期加藥，逐步通過4代左右的培養(yǎng)，得以將支原體污染徹底清除，確保試驗順利推進，結果準確。

全世界此類試劑眾多，筆者周圍的實驗人做過很多嘗試，其中效果最確切且性價比較高的當屬德國Minerva公司的ZellShield^?祛除劑。

它的原理是：通過抑制支原體增殖中某種蛋白的合成，達到抑制新的支原體增殖的目的。屬復合型的新型抗生素。

注：使用ZellShield^?時，不需使用鏈青霉素。

操作步驟：

**步：研究發(fā)現(xiàn)，98%的支原體污染發(fā)生在細胞間隙。因此，首先要把細胞消化下來，放入離心管，懸浮沖洗，離心，棄上清，反復三次。此時可將細胞上大部分的支原體去除，為進一步加藥抑制做好準備。

第二步：培養(yǎng)液中加入1%的ZellShield^?，細胞進行正常培養(yǎng)。新的支原體增殖受到抑制，舊的支原體隨著細胞的換液逐步減少，通過4代左右的培養(yǎng)，細胞中的支原體基本可被徹底清除。

此試劑價格約2800元/50ml，1%濃度使用，可保證大量細胞的實驗得以順利推進。性價比較高，但祛除過程時間稍長。

有些細胞保種中心，當珍貴細胞被支原體污染后，會將Mynox^?和ZellShield^?結合使用，效果確切，結果令人滿意。

工作環(huán)境中支原體污染，解決方案

如果實驗室的細胞經(jīng)常發(fā)生支原體污染，則需考慮的污染源可能來以下幾個方面：

1、細胞種子被污染，解決方法參見以上“方法二”和“方法三”；

2、細胞培養(yǎng)中，使用未經(jīng)嚴格過濾祛除支原體的牛血清。

某些血清生產廠，為低價占領市場同時還能獲得充足利潤，他們需要降低生產成本，所以會將生產中，成本最高的100nm過濾三次的步驟縮減，導致血清成為支原體的污染源。

(全球標準的血清生產規(guī)范為：粗血清需經(jīng)七次過濾，最后三次為100nm加壓過濾，可以清除支原體)；

此情況需詳細考察血清供貨商的專業(yè)程度，通過索要《檢測報告》等書面文件為血清獲得更多質量保證。同時，對專業(yè)水平不高的血清供貨商，適當延長血清試用期。

3、潔凈臺、細胞培養(yǎng)箱內部、培養(yǎng)箱水槽、液氮罐，培養(yǎng)間內部的水浴鍋等環(huán)境被支原體污染，可對工作區(qū)域進行消毒。有以下三種方法：

A、甲醛高錳酸鉀熏蒸消毒

• 40%甲醛溶液用量為10ml/m³，高錳酸鉀用量為5g/m³

• 先將稱好的高錳酸鉀放到開放性容器內，然后倒入甲醛溶液

• 人員迅速撤離，密閉消毒空間

• 熏蒸消毒要求密閉消毒24h以上

缺點：甲醛有刺激氣味，細胞間1-2周無法使用。

B、酒精擦拭

• 用75%的酒精對超凈臺、培養(yǎng)箱、桌面等進行擦拭

• 再通風10分鐘

• 紫外照射30分鐘

缺點：操作較為繁瑣，酒精容易揮發(fā)，消毒維持時間不長。

C、用專門清除支原體的噴霧劑或濕巾消毒

目前，被各大實驗室普遍使用的是Mycoplasma-off^TM噴霧劑和濕紙巾。它添加了可主動殺除支原體的Mynox^?試劑，可在 幾分鐘內將支原體確切殺除，無殘留，無腐蝕性，無致癌性。

• 均勻噴于待消毒的潔凈臺或實驗設備表面

• 等待5-10分鐘

• 用干燥紙巾將噴過的表面擦拭干凈

• 通風2-3分鐘

對于移液器，門把手，電話等器材，可使用支原體清除濕巾。擦拭后，應讓其被消毒物體的表面保持濕潤，再讓其自然風干。

D、培養(yǎng)箱水槽、培養(yǎng)間內部的水浴鍋

水槽經(jīng)常會成為支原體以及真菌霉菌滋生的污染源。

解決方法：

• 勤于清洗顯得尤為重要。

• 國際上普遍使用一種水源保護劑0.5%WaterShield^TM，加入水中，預防水源被支原體、真菌、霉菌污染。此試劑不易揮發(fā)。一個月有效。

水槽只需定期添水即可。

優(yōu)點：操作方便，價格便宜。