將CRISPRCas9與納米孔測序相結合實現靶向測序

為了尋找對人類基因組進行測序并讀取DNA關鍵變化的新方法，來自美國約翰霍普金斯大學醫學院的研究人員在一項新的研究中成功地使用了基因切割工具CRISPR/Cas9在較長的腫瘤基因周圍進行了DNA切割，以用于收集序列信息。他們在來自人類乳腺癌細胞和組織的基因組中進行概念驗證實驗。相關研究結果近期發表在Nature Biotechnology期刊上，論文標題為“Targeted nanopore sequencing with Cas9-guided adapter ligation”。

這些研究人員表示，將CRISPR與對人類癌癥組織的DNA成分進行測序的工具相結合有朝一日可能能夠實現對患者腫瘤的快速、相對便宜的測序，從而簡化針對高度特異性的個人基因改變的治療方法的選擇和使用。

論文通訊作者、約翰霍普金斯大學醫學院生物醫學工程助理教授、分子生物學與遺傳學助理教授Winston Timp博士說，“對于癌癥患者的腫瘤測序，你不一定需要對整個癌癥基因組進行測序。對特定的遺傳感興趣區域進行深度測序可能非常有用。”

在常規的基因組測序中，科學家們必須制造出感興趣的DNA的許多拷貝，將DNA隨機斷裂為多個片段，然后給一臺計算機機器提供這些斷裂的片段，這樣就可讀取由堿基A、C、G和T組成的核酸序列。然后，他們尋找這些斷裂片段的重疊區域，并將它們像屋頂上的瓦片一樣裝配在一起，以形成構成一個基因的較長DNA區域。

在這些實驗中，Timp和博士生Timothy Gilpatrick能夠利用CRISPR對從乳腺癌患者的一小部分腫瘤組織中分離出來的DNA進行靶向切割，從而能夠跳過常規測序的DNA復制部分。隨后，他們將所謂的“測序接頭（sequencing adaptor）”附著到DNA片段的CRISPR切割末端上。這些測序接頭充當把手的作用，將DNA引導到讀取其堿基序列的“納米孔（nanopore）”中。通過讓DNA穿過這個狹窄的納米孔，測序儀可以根據每個化學代碼（即堿基）滑過該孔時產生的獨特電流來產生DNA堿基的讀數。

在Timp團隊關注的10個乳腺癌基因中，這些研究人員能夠對乳腺癌細胞系和組織樣品進行納米孔測序，從而檢測出一種稱為甲基化的DNA改變。甲基化指的是甲基添加到基因周圍的DNA上，從而影響基因的讀取方式。

這些研究人員在一個稱為角蛋白19（KRT19）的基因中發現了DNA甲基化下降的位置。先前的研究已表明KRT19中DNA甲基化的減少與腫瘤擴散有關。

在他們研究的乳腺癌細胞系中，Timp團隊能夠實現平均每個堿基對產生400個“讀數”，這個讀數的“深度”比某些常規測序工具好數百倍。在他們的活組織檢檢查中獲得的人類乳腺癌腫瘤組織樣本中，他們能夠實現平均每個區域產生100個讀數。Timp說，“這肯定比我們用細胞系所能做的要少，但是我們必須對人類組織樣本中的DNA更加溫和，這是因為它已經被冷凍和解凍了好多次。”

除了對DNA甲基化和較小突變進行研究外，Timp團隊還對通常與乳腺癌相關的基因--- BRCA1，這個基因在基因組中的長度超過8萬個堿基---進行了測序。Gilpatrick說，“這個基因確實很長，我們能夠收集這個大而復雜的基因組區域的測序片段（sequencing reads）。”

Timp說：“鑒于我們能夠使用這種技術對比較長的基因進行測序，因此我們也許能夠捕獲到缺失的較大的DNA片段，而這些都是我們無法用更常規的測序工具所能找到的。”

Timp說，除了可以為患者提供指導治療的潛力外，CRISPR技術與納米孔測序的結合提供了如此好的深度，以至于它可能幫助科學家們找到新的針對一個等位基因（遺傳自父本或母本）而不是另一個等位基因的疾病相關基因改變。

Timp和Gilpatrick計劃繼續完善CRISPR/納米孔測序技術，并將在其他腫瘤類型中測試它的功能。