有源CRISPR酶的**個高分辨率圖像將有助于改善基因組編輯

有史以來**次，科學家們正在努力解決如何提高CRISPR技術的效率 - 一種基因編輯平臺，它使用一種名為Cas9的酶來精確切割和編輯活細胞內特定的DNA序列 - 已經捕獲了原子級，切割DNA之前和之后酶的三維圖像。

這些圖像提供了關于酶如何工作的新結構信息，并將幫助研究人員開發能夠更有效和精確地改變靶基因的酶的修飾版本。Cas9的圖像和見解由它們制成，發表在Nature Structural and Molecular Biology上。

CRISPR是一種基因編輯工具，允許科學家從DNA中切除不需要的基因或遺傳物質，或在基因中添加所需的序列以改變其功能或調節其活性。CRISPR使用一種名為Cas9的酶，它像剪刀一樣切割特定的DNA序列。一旦在DNA的任一側進行切割，細胞就會啟動修復系統，將DNA鏈的兩端重新連接在一起。

“阻止使用Cas9開發更好的基因編輯工具的主要障礙之一是我們在切割DNA后沒有任何酶的圖像，并且沒有關于這種非常重要的酶經歷執行的變化的完整信息。反應，“伊利諾伊大學芝加哥分校生物化學與分子遺傳學副教授，該論文的通訊作者Miljan Simonovic說。

早期的Cas9結構圖像已經使用X射線晶體學獲得，但這種方法具有局限性。為了捕獲結晶形式的酶的各種狀態，研究人員使用無活性的Cas9(一種不切割DNA的酶)或在不支持DNA切割的條件下形成晶體。這些過程只能在切割之前產生酶的圖像。

西蒙諾維奇說：“對調節Cas9活性感興趣的研究人員或可能工作得更好的工程突變酶只是開始時沒有完整的信息，因此進展并不像預期的那么快。”“但現在我們有了更清晰的圖像，我們甚至可以看到酶的主要結構域在反應過程中如何移動，這對于進一步探索可能很重要。”

該研究的共同資深作者，不列顛哥倫比亞大學醫學教授Sriram Subramaniam表示，能夠看到Cas9如何在如此高水平的細節上切割和編輯DNA鏈是很令人興奮的。“這些圖像為我們提供了寶貴的信息，可以提高基因編輯過程的效率，從而有望在未來更快，更準確地糾正導致疾病的DNA突變。”

Simonovic知道需要一種不同的成像技術才能真正看到Cas9在工作。在過去十年中，低溫電子顯微鏡或低溫EM已經因其在接近其自然環境的條件下以高分辨率成像大分子的能力而眾所周知。

Simonovic和他的同事使用活性Cas9以及DNA和指導RNA。加入激活酶以進行DNA切割所需的鎂，并快速冷凍Cas9復合物并使用cryo-EM成像。最終結果是Cas9捕獲在與核酸結合的三種不同結構排列中的快照。最值得注意的是，在三種狀態中的兩種中，靶DNA被切割但酶仍然與其結合，從而允許以高分辨率觀察生化反應序列的最后一步。

在**種狀態下，在切割DNA之前捕獲酶，其主要結構域“評估”待切割的序列是否合適。在第二步中，Cas9幾乎在DNA切割后立即成像。實際上，酶的活性位點懸停在DNA鏈的切割之上。并且，在第三種狀態下，酶開始向離開切割的DNA移動。

“我們發現了幾個關于Cas9如何與DNA相互作用以及它如何運作的新事物。其中一個最有趣的問題是，在反應過程中，幾個酶結構域如何協同運動并在有序狀態和無序狀態之間循環。這種酶的特征是某些結構域是西蒙諾維奇表示，穩定而其他人似乎正處于不同的構造狀態之間快速移動之前，之前沒有看到或預測過。“這些新信息可用于調節Cas9如何處理靶向DNA，并有助于設計更好的基因組編輯工具。”