乳品工業需求下的微生物分析方法的演進

發酵微生物在發酵食品物理化學和感官特性方面起著關鍵作用。它們也與食品安全相關，因為需要限制病原微生物和腐敗微生物的生長。因此，細胞活力的評估對于發酵食品工業（特別是乳品部門）通常是非常重要的。由于發酵微生物與食品的感官特性密切相關，因此需要有能力判別細胞的分裂能力，而且需要確定其代謝活動和適應性，以改善質量控制和最終產品。對于益生菌產品，若要對健康產生益處，則還需要確保存在足夠數量的活細胞。

已有一些方法用來分析參與發酵過程的微生物種群的特征。傳統是采用描述性的培養方法，它仍然是確定菌落（即可培養細胞）存在與否及其數量的最常用的方法。然而，這些簡單的方法在微生物種群生理狀態方面也存在一定的偏差，特別是其中共存幾個不同生存活力和代謝活性的亞群。于是又誕生了一些分子技術，能夠描述微生物中間狀態，以及通過標志物定量來判定菌群健康程度及新陳代謝活力的方法，而非僅僅對其生長和不生長進行定量。分子方法包括熒光原位雜交、流式細胞術、組學及PCR技術。PCR技術已在常規得到引用。

培養法是傳統常用的方法，其局限是缺乏目標菌和伴隨菌之間的鑒別、得出結果的時間、假陽性計數、食品基質影響、存在一些活而不可培養的細胞（簡稱VBNC）（即垂死細胞）。VBNC是上世紀80年代才認識到的，因而用活/死細胞染色檢測試劑盒或RT-PCR來鑒別細胞是能分裂、還是VBNC，或死亡。現在已經認識到，在活細胞和死細胞之間，存在許多中間狀態。而培養法產生的細胞對應的都是能分裂的細胞。

而人們對培養法仍然注入了許多興趣，培養基得到了改進和發展，例如用于益生菌和非益生菌的選擇性計數，酸奶、奶酪和發酵劑中雙歧桿菌的選擇性計數等。使用不同的瓊脂平板培養基，可以對許多商品進行益生菌存活率的評估。這些商品包括濃縮粉、冷凍材料、膠囊、食品和飲料等。可以確定保證活菌最低數量的益生菌效期。酸奶和奶酪中益生菌存活的影響因素也得到了研究。但由于培養法也存在一些不足，因此推薦同時采用分子鑒定的手段進行驗證，以保證結果的準確性和可靠性。這對于益生菌計數尤為重要，因為要保證必要的數量。

圖2. HiMedia公司生產的乳桿菌顯色培養基（品名，HiCrome? Lactobacillus Selective Agar Base，貨號M2065，需添加劑FD345），用于乳桿菌的分離和內部鑒別。嗜酸乳桿菌菌落淡粉色-粉色，鼠李糖乳桿菌菌落為淡綠色，發酵乳桿菌菌落為黃色，胚牙乳桿菌菌落和乳酸乳球菌乳酸亞種菌落均為淡綠色-綠色（光暈）

圖2. HiMedia公司生產的雙歧桿菌顯色培養基(品名：HiCrome? Bifidobacterium Agar，貨號M1960)，用于雙歧桿菌和乳桿菌之間的鑒別。嬰兒雙岐桿菌菌落為深藍色至藍綠色，短雙歧桿菌菌落為粉紅色（有光暈），植物乳桿菌菌落為綠色（有霧狀背景），發酵乳桿菌菌落為粉色無光暈。

用于致病菌和腐敗菌分析的顯色培養基也發展起來了，并進行了驗證和標準化。的確，李斯特菌、沙門菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希菌及其他腸道菌可通過大量顏色鑒別出來。顯色培養基使用方便，不需要分子生物學方面的知識。這在乳品微生物質控方面，無疑非常重要。其發展對彌補特異方法的不足也有幫助。

鏡檢、流式細胞術和其他熒光標記方法是否適合食品企業？將熒光原位雜交（FISH）用于乳品微生物計數已有數篇報道，例如奶酪中的丙酸桿菌檢測和計數。FISH具有高特異性，可觀察細菌在環境中的空間分布。FISH的不足是可重復性低，容易有假陽性和干擾，因而用于常規分析較為困難。流式細胞術（FC）可用于單細胞分析，能鑒別各種VBNC和生理狀態。FC已成為最有前景的標記計數，并在食品微生物學領域已有許多報告。一些熒光染料針對細胞某些組分（如核酸、蛋白質、脂類）、細胞內pH值、膜完整性和細胞內離子、活力標志物和膜能量狀態。也可采用幾種染料同時進行分析。一些學者用FC研究了食品生產或存儲過程中遇到的酸、氧化、滲透壓、冷應激對微生物細胞狀態的影響。批次培養的群體動力學、細菌噬菌體感染的早期檢測、奶酪加工溫度導致的膜變化以及抗生素效應也得到了研究。FC也被建議用于益生菌活菌計數。在細菌指數生長期，FC計數和平板計數的一致性得到了確認。其他情況下，FC計數超過平板計數0.3–1的對數數量級(CFU/g)。FC所需的分析時間更短，且可自動化。但FC無法區分屬和種，且檢測閾值較高，在牛奶中達到103 –104細胞/ml。

FC也需要一些經驗，并且有時存在假陽性。

盡管如此，FC仍然是食品工業有前景的分析工具。除了計數簡單外，FC也能提供更多細胞活力的相關信息。它有益于益生菌產品的質控。2005年，ISO發布了ISO 19344:2015，推薦了用流式細胞術測定與牛奶和奶制品相關的發酵劑、益生菌和發酵制品中乳酸菌的數量。

測序和組學的技術也發展起來，用于研究乳酸菌對環境的反應。組學也用于鑒定關鍵標志物，以篩選新的益生菌，并評估其生理狀態。使用組學技術可理解微生物行為和細胞通路，以優化工業生產過程。

在食品工業，PCR已成為檢測致病菌和腐敗菌的常規方法，得到了ISO的認可，并發展為熒光定量PCR。這些來自比較基因組學的分析，被用于微生物群體定量、乳制品加工中微生物角色評估或同時鑒定乳酸菌和益生菌的多個菌種。PCR也用于評估食品加工過程中微生物的生理狀態和活力。有一種區分活菌和死菌的方法是進行針對RNA而非DNA的RT-qPCR，但該方法仍然需要標準化。另外一種PCR方法是采用DNA嵌合染料PMA和EMA。它們只進入死細胞，能阻止DNA的PCR擴增。采用PMA-PCR和EMA-PCR進行益生菌產品中的活菌計數，發現其結果與平板計數一致性良好。

總之，目前人類對于發酵菌的生物學知識有助于開發基于菌株特異性生化反應的顯色培養基。這些顯色培養基比傳統培養基更具有鑒別力，更為特異，有助于乳品工業的微生物控制。流式方法對分析乳品、酸奶和其他發酵乳中的混合菌群很有前景，可用于質控和產品保質期的研究。但它需要優化，并需去除乳蛋白。不論何種方法，都需與標準方法驗證，并須進行方法學上的評估，以與乳制品企業的特定需求相一致。

參考文獻

Danièle Sohier, et al. Evolution of microbiological analytical methods for dairy industry needs. Frontiers in microbiology. 2014, 5: 16

HiMedia公司是國際知名微生物培養基生產商，其顯色培養基有80多種，涵蓋各個領域，包括無動物源成分及化學限定。其生產工藝具有WHO-GMP、ISO9001和ISO13485質量體系認證認證，產品有CE和FDA注冊登記，其產品行銷全球140多個國家。

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