葉酸測定用培養基

葉酸干酪培養基

原理

正常人的血清葉酸水平正常為9.9ng / ml。在身體異?；虻貌r，葉酸水平會顯著變化。葉酸干酪培養基采用干酪乳桿菌（ATCC 7469）為測定用菌，用于葉酸的微生物法測定。該培養基是基于Flynn等人(1)的配方，并經Baker等人(2)和Waters、Mollin(3)改良。用于維生素測定的測定菌通常需要三種培養基：維持培養基、接種培養基和測定用培養基。后者通常是化學限定的培養基，包含所有測定菌生長所需的養分，但不含有待測的分子。類似的，葉酸干酪培養基包含干酪乳桿菌生長所需的所有成分，但不包含葉酸。因而，添加一系列濃度增加的葉酸，會觀察到干酪乳桿菌生長反應的遞增。

干酪乳桿菌（ATCC 7469）的貯備菌制備是在AOAC推薦的乳桿菌瓊脂（貨號M366）試管穿刺接種培養，35-37°C孵育18-24小時后，試管儲存在冰箱里。每月轉接一次。測定菌液的制備是將貯備菌轉種到含10ml微量維生素檢測接種肉湯（貨號M133）或乳酸桿菌肉湯（貨號M367）的試管中。35-37°C孵育24小時后，在無菌條件下菌液離心，棄掉上清，再重懸于10ml的無菌葉酸干酪培養基中（貨號M543）。再像之前一樣沉淀，并清洗一次。最后，清洗后的菌株重懸于10ml葉酸干酪培養基中，并用該培養基進行1:100稀釋。1滴重懸液用于接種到每個測定管中。也可用0.85% NaCl代替培養基來清洗和稀釋。

由于滅菌條件，孵育溫度等因素會影響標準曲線讀數，并且每次不會完全一樣，因此每次都應制備標準曲線。10ml管內的標準品量為0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1ng。

葉酸標準品的制備：將20mg葉酸干粉溶于含有20ml乙醇的100ml蒸餾水中。用0.1N NaOH調整溶液pH值為10.0，再用0.05N HCl調pH為 7.0。該溶液含有200g葉酸/ml。用999ml蒸餾水稀釋1ml該溶液，則濃度為200ng/ml。再用999ml葉酸緩沖液A（貨號M544）稀釋1ml該溶液，則為0.2ng/ml的葉酸標準溶液。每管取0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0和5ml該溶液，配置即告完成。

血清樣本的保存：讓血液樣本凝固以分離血清。分離血清至干凈干燥的血清管，并離心除去存在的任何血細胞。小心操作，避免出現紅細胞的溶血。分裝血清樣本至于干凈干燥的試管中，每管5ml。每管加入25mg的抗壞血酸。-20°C以下溫度保存。

血清樣本的制備：解凍含有抗壞血酸的血清。向5ml樣品中加入45ml葉酸緩沖液A（M544）。孵育37℃90分鐘。然后15磅121℃高壓滅菌2.5分鐘。離心去除凝固的蛋白，將上清液轉移至清潔干燥的管中。該透明溶液即可用作葉酸待測的樣本。

樣本葉酸濃度的測定步驟：如前所述使用0.5,1.0,1.5ml或其他體積的制備好的血清提取物。加入5ml葉酸干酪培養基和足量的蒸餾水，使每個試管的總體積為10ml。15磅121°C滅菌5分鐘。冷卻試管并向每個試管中加入一滴接種液。35-37℃孵育18-24小時后進行濁度讀數。讀數前將試管冷藏15-30分鐘以停止細菌生長。620nm檢測吸光度。待測樣品中的葉酸含量應根據標準曲線來確定，不過要考慮樣品稀釋度。

應非常小心，避免培養基和玻璃器具被污染。應使用潔凈的無去污劑的玻璃器具。少量的外源物質的污染可能導致錯誤的結果。

應用

葉酸干酪培養基用于葉酸的微生物法測定。干酪乳桿菌（ATCC 7469）為測定用菌。

培養基組分

成分                                     克/升

無維生素酸水解酪蛋白                 10.000

葡萄糖                               40.000

醋酸鈉                               40.000

磷酸氫二鉀                           1.000

磷酸二氫鉀                           1.000

DL-色氨酸                            0.200

天門冬酰胺                           0.600

抗壞血酸                             4.000

L-胱氨酸鹽酸鹽                       0.500

硫酸腺嘌呤                           0.010

尿嘧啶                               0.010

黃嘌呤                               0.020

脫水山梨糖醇單油酸酯絡合物           0.100

還原型谷胱甘肽                       0.005

硫酸鎂                               0.400

氯化鈉                               0.020

硫酸亞鐵                             0.020

硫酸錳                               0.015

核黃素（維生素B2）                   0.001

對氨基苯甲酸（PABA）                0.002

鹽酸吡哆醇                           0.004

鹽酸硫胺素                           0.0004

泛酸鈣                               0.0008

煙酸                                 0.0008

生物素                               0.00002

最終pH值 (25°C)                     6.7±0.2

質量控制

?外觀——米黃色至黃色均一自由流動粉末

?制備好的培養基顏色和透明度——淡琥珀色透明溶液，可能有輕微沉淀

?配比濃度——在25°C下9.4%w/v(8.5g/100ml水）水溶液，pH值為6.7±0.1

?pH值——6.60-6.80

配置

稱取9.4g干粉培養基溶于100ml蒸餾水，加入50mg抗壞血酸。加熱至沸騰使培養基完全溶解。測定時，分裝至每管為5ml培養基（包含標準品和待測樣品）。加蒸餾水，使總體積達到10ml。高壓消毒15磅121°C 5分鐘。立即冷卻。

培養反應

采用干酪乳桿菌（ATCC 7469）進行葉酸的微生物法測定。35-37°C孵育16-18小時。

生長狀況

可獲得良好的生長。隨著測定管葉酸標準品濃度升高（即 0, 0.1,0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1ng），干酪乳桿菌生長逐漸遞增，伴隨著620nm處吸光度的增加。

文獻

1. Flynn, Williams, ODell and Hogan, 1951, Anal. Chem., 23, 180.

2. Baker, Herbert, Frank, Pasher, Hunter, Wasserman and Sobotka, 1959,Clin. Chem., 5, 275.

3. Waters and Mollin, 1961, J. Clin. Path., 14, 335.